Читайте также:
|
Цатурова К.А. Физическая культура в России.
Выделение и накопление вирусов на биологических моделях
Выделение вирусов на лабораторных животных.
Чаще всего в вирусологии в качестве биомоделей используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов, цыплят. Иногда используют также золотистых хомячков, утят и других животных. Условия использования лабораторных животных в качестве биомодели: Животные должны быть здоровы, получены из благополучного в отношении заразных болезней питомника, чувствительны к конкретному вирусу, стандартны (то есть одинаковы по полу, физиологическому состоянию, весу). Выбор лабораторных животных зависит от вида вируса.
Иногда при первом заражении у лабораторного животного не проявляются клинические признаки и патологоанатомические изменения, оно не погибает и остаётся здоровым. Тогда приходится проводить 3-5 «слепых», бессимптомных пассажей (перезаражений), прежде чем удастся адаптировать вирус к лабораторным условиям. Однако к некоторым вирусам лабораторные животные в принципе не чувствительны, в этом случае приходится использовать естественно восприимчивых животных, как, например, при чуме свиней и инфекционной анемии лошадей.
Цель заражения лабораторных животных:
1. Изучение патогенеза болезни;
2. Выделение вируса из пат.материала;
3. Наработка иммунных и гипериммунных сывороток;
4. Наработка вакцин;
5. Поддержание вирусов в условиях лаборатории;
6. Титрация, с целью определения количества вируса в единице объема;
7. Лаб. Животные - биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;
Различают много способов введения вируссодержащего материала в организм животных:
- Подкожный; - Интрацеребральный;
- Внутрикожный; - Интраперитониальный;
- Внутримышечный; - Интраокулярный;
- Внутривеннвй; - Интранозальный;
- Алиментарный;
Выбор метода заражения лабораторных животных зависит от тропизма вируса. Так, при культивировании нейротропных вирусов животных заражают интрацеребрально (в головной мозг); респираторных - интраназально, интратрахеально; дерматропных – подкожно и внутрикожно.Заражение производят с соблюдением правил асептики и антисептики.
После заражения животных метят, помещают в изолированный бокс и ведут наблюдение в течение 10 суток. Гибель животного в первые сутки после заражения считается неспецифичной и в дальнейшем не учитывается. 3 признака указывают на результативность заражения: наличие клинических признаковгибель животного; патологоанатомические изменения в их органах и тканях.
2. Выделение вирусов на куриных эмбрионах
Куриный эмбрион - это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на куриных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бактерий - бруцеллы, риккетсии, вибрионы.
Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особенно оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, является благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.), успешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную полость. Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.
Преимущества использования куриных эмбрионов:
1.Экономически выгодно, кроме того яйца легко доступны;
2.У развивающихся куриных эмбрионов отсутствуют защитные механизмы, т.к. система иммунитета еще не развита;
3.Скорлупа яиц препятствует проникновению через неё бактерий и вирусов из окружающей среды;
4.Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрионах требуется очень несложное оборудование - обычный термостат или инкубатор.
Условия использования КЭ в вирусологии:
1.Яйца получают из хозяйств заведомо благополучных по инфекционным заболеваниям;
2.Куриные эмбрионы лучше получать от белых пород кур (леггорн, русская белая), т. к. они более устойчивы к манипуляциям и не гибнут от маленьких травм. Кроме того, у них скорлупа белая и более прозрачная, чем у других пород, и легче просвечивается, что удобно для просмотра и наблюдения в процессе работы с ними;
3. Для инкубирования отбирают оплодотворенные яйца снесенные не более 10 суток тому назад;
4. Берут незагрязненные яйца, т. к. мыть их перед инкубированием нельзя, а грязные яйца хуже просвечиваются при просмотре (овоскопии) и при работе с ними можно инфицировать эмбрион в процессе манипулирования;
Инкубируют яйца в инкубаторе или в термостате с водяным нагревом и доступом воздуха, причем в процессе инкубации в термостате яйца 2-3 раза в сутки нужно переворачивать и для лучшего газообмена вынимать на 5-10 минут на воздух. Для поддержания определенной влажности в термостат ставят сосуд с водой для испарения, температура в термостате должна быть 38°.
Развитие зародыша происходит уже в первые сутки инкубирования, происходит закладка головного мозга, скелета. Строение куриного эмбриона в возрасте 7-9 дней (см. тетрадь).
Для заражения наиболее часто используют эмбрионы 7-12 суточного возраста. Работу с куриными эмбрионами проводят в стерильной комнате-боксе со строжайшим соблюдением асептики.
Цель заражения куриных эмбрионов:
1. Выделить вырус из патматериала;
2. Наработка вакцин;
3. Поддержание вируса в условиях лаборатории;
4. Титрация вирусов;
5. Биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;
6. Изучение интерференции вирусов и наработка интерферона;
Заражение куриных эмбрионов:
Для заражения нужно отбирать жизнеспособные эмбрионы с хорошо выраженной подвижностью. Перед заражением все эмбрионы тщательно просматривают в затемненной комнате на овоскопе
Во время просвечивания эмбрионов перед заражением на скорлупе простым карандашом обрисовывают пугу (воздушную полость), ход крупных кровеносных сосудов и место предлежания эмбриона, т. е. участок на скорлупе, где ближе всего к ней лежит эмбрион. Отметка пуги, места предлежания эмбрирна и хода крупных кровеносных сосудов затем служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала в момент заражения.
Отобранные для заражения куриные эмбрионы переносят в бокс, где и проводят с ними работу. Перед заражением скорлупу по месту введения материала дважды обрабатывают йодированным спиртом и обжигают. Доза заражения составляет 0,1-0,2 смз.
В зависимости от вида вируса и цели заражения имеются различные методы введения вируссодержащего материала:
1) Заражение на хорионаллантоисную обалрчку, используют эмбрионы 7—12-суточного возраста при выделении и культивировании нейротропных, дерматропных н некоторых пантропных вирусов (оспа, энцефаломиелит, ИЛТ, ящур, бешенство, чума и др.). Существует 3 варианта заражения:
а)вскрывают пугу и срезают ее ножницами, отделяют
подскорлупную оболочку и наносят на хорионаллантоисную
оболочку (ХАО) материал. Отверстие в яйце затем закрывают
стерильным стеклянным колпачком и края колпачка
парафинируют;
б) выпиливают надфилем (напильничек) или зазубренным скаль-
пелем в скорлупе треугольник с длиной сторон около 1 см на
границе пуги со стороны предлежания эмбриона, пинцетом
удаляют участок скорлупы и подскордупной оболочки и вводят
материал. Отверстие закрывают покровным стерильным
стеклом и края парафинируют, или заклеивают стерильным
лейкопластырем.
в)скальпелем удаляют небольшой участок скорлупы площадью
около 0,5 см по месту предлежания эмбриона, затем пинцетом
или иглой удаляют в этом участке подскорлупную оболочку и
вводят материал. Если материал плохо входит в полость яйца, можно с помощью резиновой груши через отверстие в скорлупе на пуге откачать воздух из пуги и в результате по месту введения материала образуется искусственная пуга и тогда материал легко вводится. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.
2) Заражение в аллантоисную полость. Этот метод заражения
очень прост и применяется для выделения многих вирусов. Для
заражения берут 10-11-дневные эмбрионы. Имеется два варианта
заражения:
а) заражение проводят через пугу, не срезая ее. Иглой отмеряют
расстояние от верхушки пуги до границы пуги, отмеченной
карандашом на скорлупе, и вводят иглу на отмеченную глубину
и углубляют еще на 0,5 см, чтобы проколоть
хорионаллантоисную оболочку;
б) вводят материал иглой через прокол в скорлупе в месте
предлежания эмбриона на глубину 3-5 мм в бессосудистом
участке. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.
3) Заражение в желточный мешок.
Для заражения используют 5-8-суточные эмбрионы.
Существует два варианта заражения:
а) иглу вводят со стороны пуги в желточный мешок под углом 45о
к месту предлежания эмбриона под контролем овоскопа;
б) яйцо кладут на подставку также местом предлежания
эмбриона вниз и иглу вводят сверху вниз по направлению к
эмбриону на глубину около 1 см.
Место введения заклеивают лейкопластырем и парафинируют.
4) Заражение в амниотическую полость.
При этом методе заражения вирус может проникнуть
в различные клетки,находящиеся в контакте с амниотической
жидкостью, и размножаться в них. для удобства заражения
рекомендуется за 2-3 дня до проведения заражения эмбрионы
инкубировать пугой вверх. Тогда эмбрион и амнион смещаются вверх
и удобнее заражать. Имеется два варианта заражения:
а) вскрывают и срезают пугу, пинцетом удаляют подскорлупную
оболочку и захватывают амниона подтягивают амнион
пинцетом и вводят в амниотическую полость материал в дозе
0,1 мл. Отверстие в скорлупе затем закрывают стерильным
стеклянным колпачком и края парафинируют;
б) заражение с помощью длинной иглы через пугу в темной
комнате под контролем глаза, У иглы предварительно острие
загибают под прямым углом, чтобы получилась маленькая
площадка. Иглу вводят под контролем глаза через пугу до эмбриона,
под давлением затупленной иглы эмбрион в этом случае будет
смещаться, затем легким толчком прокалывают амнион и иглу
слегка оттягивают назад. При этом эмбрион должен смещаться за иглой вверх.
Затем вводят материал.
5) Заражение в тело эмбриона и заражение в головной мозг.
Используются 7-12-дневные эмбрионы, заражение проводят
введением материала в различные участки тела или непосредственно
в головной мозг. Для заражения вскрывают пугу и подтягивают
пинцетом эмбрион. При этих методах заражения может быть гибель
эмбрионов от травмы до 30 % и более от числа зараженных.
6) Заражение в крупные кровеносные сосуды
хорионаллантоисной оболочки. Этот метод заражения, как и
предыдущий, применяется очень редко. Материал вводят тонкой
иглой после удаления скорлупы по ходу кровеносного сосуда
непосредственно в сосуд по току крови.
После заражения куриные эмбрионы обязательно метят простым карандашом и ставят в термостат. За ними ежедневно наблюдают путем просмотра, наблюдение ведут до 7-8 дней в зависимости от вида вируса. В случае гибели эмбрионов их срочно удаляют из термостата и ставят в холодильник до момента вскрытия. Если эмбрион погиб в течение первых 14-18 часов, это может быть от травмы или токсичности патматериала. Поэтому, так же как и при заражении лабораторных животных, в сомнительных случаях рекомендуется, делать несколько пассажей и в опыт брать на каждый материал по несколько эмбрионов.
Вскрытие погибших зараженных куриных эмбрионов, или изъятых по истечении срока наблюдения производится со всеми правилами асептики в стерильных условиях бокса. При вскрытии скорлупу обрабатывают спиртом и обжигают, затем срезают пугу. У вскрытого эмбриона сначала тщательно отсасывают аллантоисную жидкость (количество ее около 7 мл), затем пинцетом оттягивают амниотическую оболочку, прокалывают пастеровской пипеткой и отсасывают амниотическую жидкость (количество ее 1,0-1,5 мл), затем собирают желток, извлекают оболочки и сам эмбрион. Жидкость, оболочки и сам эмбрион тщательно осматривают на наличие изменений. Амниотическая жидкость в норме совершенно прозрачная, при заражении она может быть мутная, кровянистая. Характерные изменения, вызванные вирусом, бывают наиболее выраженными на хорионаллантоисной оболочке: появляютсявоспалительные очаги, непрозрачные, круглой формы и кровоизлияния. Кровоизлияния могут быть на теле эмбриона. Весь материал собирают в стерильную посуду.
Куриные эмбрионы в вирусологии широко применяются не только для выделения вирусов, но и для накопления и получения антигенов, для приготовления живых и убитых вакцин, титрования вирусов, для постановки реакции нейтрализации вирусов, для аттенуирования (ослабления) вирусов, для изучения интерференции вирусов и получения интерферона.
Методы заражения куриных эмбрионов:
На ХАО В желточный мешок
|
|
1. В аллантоисную полость В амнион.
|
 |  | ||
Дата добавления: 2014-12-15; просмотров: 94 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |
| Постановление 1925 года. | | | I Крестьянская реформа 1861 г. |