Читайте также:
|
Методы выделения и синтеза генов. Основной инструментарий генной инженерии.
Выделение и очистка ДНК.
Прежде всего находят найти нужный ген. Для этого применяется физическое картирование. Это приемы, с помощью которых определяется сайт рестрикции, т.е. место расщепления ДНК. Другой прием заключается в том, что выделяется мРНК, а затем она переводится в ДНК. Для поиска нужного гена используют такие приемы как мечение интересующего фрагмента ДНК флуоресцирующей меткой, а также иммунологические методы с использованием антител.
Для получения большого количества относительно чистой ДНК необходимо механическое или ферментативное разрушение клеток для освобождения их содержимого. Следующий этап - очистка нуклеиновых кислот от белков и полисахаридов. Эта задача решается путем комбинирования использования методов центрифугирования, электрофореза, адсорбции на специфических субстратах или путем осаждения с неводными растворителями. При выделении ДНК используют мягкие условия разрушения клеток и ингибируют такие ферменты как ДНКазы и РНКазы, чтобы предотвратить гидролиз нуклеиновых кислот. Это могут быть, фенол, детергенты или специфические ингибиторы из тканей животных.
Разрезание молекулы ДНК. ДНК можно разрезать, используя механические или ферментативные методы. При первом способе ДНК разрывается гидродинамически при пропускании ее через капилляр. Механические воздействия и приводит к генерации случайных фрагментов ДНК, которые могут быть использованы для создания геномных библиотек. При этом невозможно выделить специфический фрагмент, содержащий определенный ген или оперон. Метод применялся в 60-7- годы.
В противоположность этому, при разрезании ДНК с использованием рестрикционных эндонуклеаз, которые узнают и разрезают специфические последовательности в двухспиральной ДНК (сайты рестрикции), можно выделить специфические фрагменты. Из микроорганизмов разных видов выделено несколько сотен рестрикционных эндонкуклеаз, и их число продолжает расти. Выделяют несколько классов рестрикционных эндонуклеаз с различными биохимическими свойствами.
Для ограничения числа сайтов рестрикции и получения более крупных фрагментов используют ферменты метилазы. Сшивание молекул ДНК происходит с участием ферментов, называемых лигазами. Широко используются также ДНК-полимеразы, ведущие матричный синтез ДНК, среди них обратная транскриптаза, о которой мы упоминали выше.
Развитие методики текстологической подготовки
Дата добавления: 2014-12-15; просмотров: 26 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |