Читайте также:
|
Генна інженерія
Можливість вираження вказаних генів, які визначають синтез протективних антигенів, як і генів взагалі, залежить від забезпечення всіх етапів їх транскрипції, трансляції і пост трансляційного процесингу їх продуктів.
Основні принципи клонування геному патогенних мікроорганізмів
Як і в будь – якій дослідницькій роботі, за допомогою методів генної інженерії, що застосовуються до збудників інфекційних хвороб, можна вирішувати задачі двох типів: фундаментальні і прикладні. До числа фундаментальних проблем відносяться: 1) генетичне картування і молекулярне клонування генів, що кодують фактори патогенності, з метою подальшого дослідження структури цих генів; 2) дослідження особливостей регуляції вираження генів, що має велике значення в конструюванні вакцин; 3) вивчення експресії генів маловивчених в генетичному відношенні збудників у клітинах добре вивчених мікроорганізмів, наприклад Escherichia coli. Внаслідок особливо важливих для детермінант патогенності збудників особливо небезпечних інфекцій.
До числа прикладних задач відносять створення за допомогою методів генної інженерії продуцентів різних біологічно активних продуктів, які можуть бути речовинами як бактеріального або вірусного (токсини, ферменти), так і еукаріотичного походження. Завдання утворення за допомогою методів генної інженерії вакцинних препаратів вирішується двома шляхами: 2) шляхом утворення продуценту протективного антигену, який в подальшому використовується для напрацювання основного компоненту хімічної вакцини, 1) шляхом утворення живої вакцини, основу якої складає безпечний штам, здатний продукувати протективний антиген.
Для клонування генів кодуючих структуру протективних антигенів ДНК об’єкт піддається дії однієї і більше рестрикційних ендонуклеаз, і отримані фрагменти вбудовуються у векторні плазміди або вектори. Існує вже доволі великий набір векторів, які, з одного боку, забезпечують вираження клонованих фрагментів з промоторів вектора, з іншої – дозволяють вводити клоновані фрагменти в нове генетичне оточення, наприклад в клітини Е. coli або інших кишечних бактерій, дріжджів або в клітини макроорганізмів.
Завдння виявлення клону, що успадкував рекомбінантну плазміну з потрібним геном, вирішується за допомогою поєднання генетичних та імунологічних методів. Від десятків тисяч до міліонів трансформантів обробляють антитілами до того продукту, генетично детермінанта якого підлягає клонуванню. Інколи на першому етапі потрібні клони виявляють за допомогою сироватки, яка містить суміш антитіл до всіх антигенів збудника. Потім, застосовуючи моноклональні антитіла і метод імуноблотінга виявляють, який саме поліпептид синтезується знайденим клоном. Клони, які виявилися продуцентами речовин, які реагують з антитілами, виділяють і піддають подальшому аналізу на імунологічному молекулярно-генетичному рівнях.
Існують 2 суттєві проблеми: нестабільність різнорідних білків в E.coli, обумовлена діями протеаз цього мікроорганізму, і токсичність продуктів багатьох по сторонніх генів для E.coli. Перша проблема вирішується в наш час за допомогою отримання так званих злитих генів, які визначають синтез химерних (комбінованих) білків, які складаються з досліджуваного антигену і будь-якого білку клітини-хазяїна. Другу проблему можна обминути, якщо поставити клонований ген під регулюючий промоутер, включити експресію не в логарифмічній, а у пізній фазі росту культури. У такому випадку бактерії встигнуть перед тим, як загинуть синтезувати значну кількість продукту.
Методи клонування дозволяють одержати штам, який синтезує тільки антиген того чи іншого збудника і який позбавлений шкідливих для макроорганізму властивостей. Такий штам може бути використаний або для отримання хімічної вакцини, або як основа для конструювання живої вакцини.
Дата добавления: 2015-02-22; просмотров: 35 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |