Читайте также:
|
Перед тим як перейти до викладення самих експериментів, необхідно виділити, що прогрес в одержанні холерної вакцини пов’язаний з попереднім інтенсивним дослідженням структури і функції молекули холерного токсину(СТ) і генетичної організації детермінант токсиноутворення у холерного вібріона.
Більшість антитіл знайдених в крові реконвалесцентів, направлені проти СТ і ліполісахарида клітинної стінки V.cholerae. В експериментах на тваринах встановлено протекторна роль обох типів антитіл і показаний їх синергізм.
У зв’язку з тим, що молекулярна біологія СТ була вивчена набагато глибше, чим інших антигенів V.cholerae, розробка генно-інженерних вакцин проти цього збудника пішла по шляху утворення продуцентів протекторного антигена, утворюючого антитоксичний імунітет.
Вивчення СТ проходило одночасно і приблизно однаковими темпами з вивченням термолабільного ентеротоксину E.coli (LT). Встановлено, що СТ і LT мають майже 80% гомології, тому штами, що продукують LT і що називаються ентеротоксигенними E.coli (ЕТЕС), викликають захворювання з синдромом дуже нагадуючий холерний. Діареї, які викликають ЕТЕС, поширені ширше і зустрічаються частіше, ніж холера, але проходять з менш вираженими симптомами. Вони призводять до високої смертності дітей в країнах Азії, Африки і Латинської Америки. Тому захист проти ЕТЕС і холерних вібріонів єдина проблема.
Обидва токсини сладаються з двох субодиниць − А і В. Молекула токсину звичайно містить 5 субодиниць В і 1 субодиницю А. Субодиниця А відповідальна за токсичність. Субодиниця В забезпечує прикріплення молекули токсину до специфічних клітинних рецепторів.
Вивчення імунітету при холерній інфекції показало, що основним протективним антигеном, індукуючим синтез антитоксичних IgA в лімфоїдних утвореннях тонкого кишечника, являється субодиниця В (СТ-В). Саме секреторні антитіла, що утворюються в результаті розвитку місцевої імунної відповіді, мають основне значення в захисті від холерної інфекції.
Таким чином, конструювання штаму, що продукує субодиницю В, але не здатного до синтезу субодиниці А, - необхідний етап для створення як живої, так і хімічної пероральних вакцин на основі субодиниці В.
В Центрі розвитку вакцин J. Kaper і співавт. пішли по шляху утворення вакцинного штаму за допомогою методіів генної інженерії. Перш за все були клоновані гени vctAB холерного вібріона і визначена їх нуклеотидна послідовність. Потім був клонований фрагмент ДНК, що містив тільки ген vctB, тобто продукуючий лише СТ-В. Цей ген був поставлений під транскрипційний контроль сильного промотора гена trp Serratia marcescens. Отримана плазміда являється похідною pBR325 і позначена pjBK1.
Слідуючим необхідним етапом дослідження було створення реципієнтного штаму. Для цього був клонований фрагмент ДНК, що містить ген vct-оперона. Отримана плазміда була позначена pJBK16. Рестрикціонна карта цього району хромосоми V. cholerae була побудована рвніше. Використовуючи дані рестрикційного картування, дослідники підібрали рестрикційні ендонуклеази, сайти які знаходяться на фалангах vct-оперона. Оброблення цими ферментами і наступне лігірування дозволили повністю видалити з плазміди pJBK16
vct-оперон, але зберегти оточуюуі його послідовності. На місце оперона vct в отриманій плазміді за допомогою методики клонування був вбудований ген, що кодує стійкість до ампіціліну (bla). Потім за допомогою тих же методів була сконструйована плазміда pJBK54, в якої ген bla був оточений вже не короткими, а протяжними (7 і 9 т.п.н.) фрагментами хромосомної ДНК V. cholerae, що належить до vct-оперону. Після цього вказаний район був переклонований в плазміду, що відноситься до групи несумісності lucP.Отримана плазміда позначили pJBK55.
Плазміда pJBK55 була введена в штам № 16961 V. cholerae біотипу Ель-Тор серотипу Інаба. Цей штам містив свої хромосоми vct-оперон. В зв'язку з наявності гомології між плазмідою і хромосомою по ділянках, які оточують vct-оперон, з низькою ймовірністю вібувалися рекомбінантні обміни. Їх результатом було заміщення хромосомного vct-оперону фрагментом плазміди, який містить ген bla.
Дата добавления: 2015-02-22; просмотров: 30 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |