Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Методичні вказівки з діагностики сапу

Н А К А З

11.06.2010 м. Київ № 214

Про затвердження Методичних

вказівок з діагностики сапу

Відповідно до статті 7 Закону України „Про ветеринарну медицину”, Положення про Державний комітет ветеринарної медицини України, затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 30 серпня 2007 року № 1075, з метою забезпечення епізоотичного благополуччя в Україні

Н А К А З У Ю:

1. Затвердити Методичні вказівки з діагностики сапу, що додаються.

2. Управлінню забезпечення протиепізоотичної роботи (Мороз Д.А.) забезпечити його надсилання головним управлінням ветеринарної медицини в Автономній Республіці Крим, областях, містах Києві та Севастополі.

3. Начальникам головних управлінь ветеринарної медицини в Автономній Республіці Крим, областях, містах Києві та Севастополі довести зазначені Методичні вказівки з діагностики сапу до відома територіальних органів Державного комітету ветеринарної медицини та забезпечити контроль за їх виконанням.

4. Цей наказ набирає чинності з дня офіційного опублікування.

5. Контроль за виконанням цього наказу покласти на начальника управління забезпечення протиепізоотичної роботи Держкомветмедицини Мороза Д.А.

Голова І.Ю. Бісюк

ЗАТВЕРДЖЕНО:

Наказ Державного комітету

ветеринарної медицини

України

11.06.2010 р. № 214

Методичні вказівки з діагностики сапу

1. Клінічний огляд

1.1. При проведенні клінічного огляду звертають увагу на стан шкіряного покрову, поверхневих лімфатичних вузлів і судин, слизової оболонки носової порожнини, загальний стан здоров’я тварини.

По клінічному перебігу хвороби розрізняють сап носовий, шкіряний і легеневий. Іноді всі три клінічні форми можуть бути виражені одночасно.

1.1.1. При носовому сапі на слизовій оболонці носової порожнини з’являються дрібні жовтуваті вузлики, обведені червоним колом. На їх місці утворюються характерні виразки і зірчасті рубці.

Розвиток виразок супроводжується гнійними виділеннями з носу іноді з домішками крові, а також підпуханням підщелепових лімфатичних вузлів.

1.1.2. При сапних, поверхневих ураженнях шкіри спостерігають пустули, виразки з гнійним вмістом або заповнені грануляційною тканиною.

При неглибоких ураженнях в товщі шкіри виявляють тверді вузлики з гнійно-некротичним вмістом на розрізі, виразки чи рубці, які можуть бути розміщені по ходу лімфатичних судин.

1.1.3. При ураженнях легенів спостерігають глухий кашель, швидку втомлюваність тварини, періодичні підйоми температури тіла вище 38,5°С.

2. Алергічні дослідження

Для алергічного дослідження на сап застосовують малеїн, що являє собою стерильний культуральний фільтрат з вузлика сапу вирощеного на рідкому поживному середовищі.

При діагностиці хвороби застосовують очну і підшкірну малеїнові проби.

2.1. Очна малеїнова проба.

2.1.1. Протягом доби перед проведенням дослідження коні, віслюки, мули, лошаки, верблюди повинні бути протягом доби звільнені від фізичного навантаження і утримуватись на прив’язі. Дослідження тварин, що мають кон’юнктивіти і інші захворювання очей, очною пробою не проводять.

За допомогою очної піпетки досліджуваним тваринам наносять 3–4 краплі малеїну на кон’юнктиву одного ока при відтягнутому нижньому віці. Облік реакції проводять через 3, 6, 9, 12 і 24 години шляхом огляду слизової оболонки ока.

Позитивна реакція характеризується довготривалою або короткотривалою гіперемією і опуханням кон’юнктиви різного ступеня з гнійними виділеннями з внутрішньої частини ока або накопиченням гною в кон’юнктивальному мішку.

Реакцію вважають негативною при відсутності будь-яких змін або при слабому почервонінні кон’юнктиви і сльозотечі.

2.1.2. Через 5–6 діб тваринам, не реагуючим на першу аплікацію алергену, препарат наносять другий раз в тій же дозі на кон’юнктиву того ж ока.

Облік реакції проводять як вказано в п. 2.1.1.

2.2. Підшкірна малеїнова проба.

2.2.1. Підшкірну малеїнову пробу застосовують не раніше 45 днів після попередньої підшкірної проби. Перед її проведенням тварин витримують на прив’язі не менше доби і поять підігрітою водою, проводять термометрію через 7–8, 14–15, 21–24 годин.

Дослідження тварин з короткочасним або довготривалим підвищенням температури до 39°С і вище підшкірною малеїновою пробою не проводять.

2.2.2. Здоровим тваринам малеїн вводять підшкірно в ділянці підгрудка в дозі 1см³.

Облік температури тіла і реакцію в місці введення алергену проводять через 6–8, 10–12, 14–16, 20–24 і 30–36 годин. Позитивна реакція характеризується поступовим підвищенням температури до 39,6°С і вище та повільним її спадом з можливим повторним підвищенням через 30–36 годин, а також утворенням на місці введення малеїну припухлості різного ступеня вираженості.

Реакцію вважають негативною при нормальній температурі тіла або короткочасному підвищенні не вище 39,5°С і відсутністю змін в місці введення малеїну.

3. Серологічні дослідження

Лабораторні дослідження на сап проводять у лабораторіях, які мають дозвіл на роботу зі збудниками 2–4 групи патогенності.

3.1. Пластинчата реакція аглютинації (РА) з сапним кольоровим антигеном.

3.1.1. Антиген сапний кольоровий для пластинчатої РА являє собою гомогенну суспензію в буферному розчині інактивованої забарвленої культури збудника сапу. При зберіганні допускається утворення осаду, що перетворюється в гомогенну суспензію при струшуванні. Перед використанням флакони з антигеном витримують протягом 15–20 хвилин при температурі 18-30°С і струшують.

3.1.1.2. Досліджувана сироватка крові коней нативна або консервована.

Консервування сироватки крові проводять кристалами борної кислоти (2–4% до об’єму сироватки) до отримання насиченого розчину або шляхом одноразового заморожування.

Не консервована сироватка крові придатна для дослідження протягом 5 діб з дня взяття із збереженням її при температурі 4–8°С. Сироватка, консервована борною кислотою, придатна для дослідження протягом 10 діб, заморожена сироватка протягом 3 діб після одноразового розморожування.

Дослідженню на сап не підлягають мутні, гемолізовані сироватки крові.

3.1.1.3. Сироватка сапна для РА і РЗК (позитивна сироватка) виготовляється на біопідприємствах.

3.1.1.4. Сироватка крові коней неспецифічна неконсервована (негативна сироватка) виготовляється на біопідприємствах.

3.1.1.5. Фізіологічний розчин – 0,85% розчин хлориду натрію з рН 6,8–7,2. Корекцію рН проводять 10% розчином соляної кислоти або 10% розчином гідроокису натрію.

3.1.2. Постановка РА.

Реакцію проводять при температурі 18–30°С на чистих сухих металевих емальованих пластинках з лунками. На краях пластинки проти кожної лунки записують номер досліджуваної сироватки крові.

Спочатку ставлять контроль антигену з позитивною і з негативною сапними сироватками крові коней, а також контроль антигену на спонтанну аглютинацію (до 0,03 см³ антигену додають 0,03 см³ сироватки або фізіологічного розчину). Досліджувані сироватки крові в дозі 0,03 см³ вносять на дно лунки за допомогою дозатора (піпетки). В кожну лунку поряд із сироваткою дозатором вносять 0,03 см³ антигену. Потім антиген в кожній лунці змішують з сироваткою ручним змішувачем до отримання однорідної суміші, розмішуючи її по всій поверхні лунки. Пластинку з сироватками і антигеном погойдують протягом 4 хвилин обережними круговими рухами вручну або за допомогою апарату для погойдування діагностичних пластинок.

3.1.3. Облік результатів реакції проводять візуально через 4 хвилини після змішування сироватки крові з антигеном при злегка нахиленому положенні пластинки. Реакцію вважають позитивною при наявності чітко вираженої аглютинації забарвлених сапних бактерій антигену у вигляді дрібних чи великих пластівців при 75–100% просвітленні рідини (3–4 хрести). Реакцію вважають негативною при оцінці менше (3–4 хрестів).

++++ (4 хрести) – виражена аглютинація у вигляді великих пластівців рожевого кольору з повним просвітленням рідини;

+++ (3 хрести) – незначні пластівці з не повним (75%) просвітлінням рідини;

++ (2 хрести) – аглютинат у вигляді дрібних пластівців, з не повним (50%) просвітленням рідини;

+ (1 хрест) – дрібно зернистий аглютинат, з не повним (25%) просвітленням рідини;

- (мінус) – відсутність аглютинації, суміш гомогенна, рівномірно забарвлена.

3.1.4. Після обліку реакції пластинки і змішувач дезінфікують занурюючи їх на 5 хвилин в 1% розчин хлораміну або віркону, потім миють у миючому розчині, споліскують в проточній потім в дистильованій воді, висушують і використовують повторно.

3.2. Реакція зв’язування комплементу (РЗК).

3.2.1. Компоненти реакції.

3.2.1.1. Антиген сапний для РЗК.

3.2.1.2. Досліджувана сироватка крові коней, нативна або консервована (п.3.1.1.2.).

3.2.1.3. Сироватка сапна для РА і РЗК (позитивна сироватка).

3.2.1.4. Сироватка крові коней неспецифічна, неконсервована (негативна сироватка) виготовляється на біопідприємствах.

3.2.1.5. Сироватка гемолітична для РЗК, виготовлена на біопідприємствах.

3.2.1.6. Комплемент сухий для РЗК, виготовлений на біопідприємствах.

3.2.1.7. Фізіологічний розчин (по п. 3.1.1.5.).

3.2.1.8. 2,5% суспензія еритроцитів барана у фізіологічному розчині. Кров у барана беруть вранці до годівлі, з яремної вени у флакон з скляними або металевими бусами, при цьому струшують протягом 7–10 хвилин або консервують розчином Альсівера. Еритроцити шляхом центрифугування при 2,5–3 тис. об./хв. відмивають фізіологічним розчином до повного знебарвлення промивної рідини. Із осаду еритроцитів готують 2,5% суспензію у фізіологічному розчині.

3.2.2. Титрування гемолітичної сироватки (гемолізину).

Титрування гемолізину проводять один раз у три місяці, а також при використанні нової серії. Із основного розведення гемолізину 1:100 (0,1см³ гемолізину і 9,9 см³ фізіологічного розчину) готують такі розведення (табл.1).

Таблиця 1

Схема розведення гемолізину

Після чого по 0,2 см³ кожного розведення переносять в ряд пробірок, в кожну пробірку добавляють по 0,2 см³ комплементу в розведенні 1:20, 0,2см³ 2,5% суміші еритроцитів і 0,4 см³ фізіологічного розчину. Штатив з пробірками струшують і ставлять на 10 хвилин у водяну баню при температурі 37–38°С.

Титром гемолізину вважають найбільше його розведення, при якому спостерігається повний гемоліз еритроцитів.

3.2.3. Приготування гемолітичної системи.

Гемолітичну систему готують змішуванням в рівних об’ємах, 2,5% суміші еритроцитів барана та гемолітичної сироватки (гемолізин у подвоєному титрі).

Наприклад, при титрі гемолізину 1:1000 беруть 2:1000, тобто для приготування 100 см³ гемолізину беруть 0,2 см³ гемолізину з ампули і розводять в 99,8 см³ фізіологічного розчину.Отримані 100 см³ розчину гемолізину змішують з 100 см³ суміші еритроцитів. Гемолітичну систему поміщають на 20 хвилин у водяну баню при температурі 37–38°С для сенсибілізації еритроцитів.

3.2.4. Титрування комплементу.

Перед постановкою головного дослідження проводять титрування комплементу у бактеріолітичній системі з позитивною сапною і негативною сироватками та 1–2 сироватками з досліджуваної партії.

Позитивну, негативну сироватку та сироватку з партії розводять 1:10 фізіологічним розчином (1 см³ сироватки та 9 см³ фізіологічного розчину) та інактивують при температурі 60–62°С протягом 30 хвилин і розливають по 0,2 см³ в два ряди по десять пробірок.

Відбирають необхідну для даного об’єму досліджень кількість ампул (флаконів) з комплементом, розчиняють препарат у фізіологічному розчині, кількість якого вказана на ампулі (флаконі), зливають в одну ємність і перемішують. Таким чином отримують основний розчин комплементу, який зберігають в холодильнику протягом постановки реакції. З цього розчину готують розведення 1: 20 для титрування.

Для розведення комплементу беруть додатковий ряд пробірок, в яких готують попереднє розведення комплементу, але об’єм збільшують в 10 раз. Потім дозатором переносять по 0,2 см³ розведеного комплементу у всі пробірки кожного ряду і вносять інші інгредієнти, як вказано в таблиці 2.

Таблиця 2

Схема титрування комплементу в бактеріолітичній системі

Примітка: ЧГ- частковий гемоліз; ПГ- повний гемоліз.

Титром комплементу в бактеріолітичній системі вважають мінімальну його кількість, яка необхідна для повного гемолізу суспензії еритроцитів в пробірках з негативною та досліджуваними сироватками з антигеном і без антигену, а також в пробірках з позитивною сироваткою без антигену протягом 20 хвилин у водяній бані при 37–38°С та затримку гемолізу в пробірках з сапною сироваткою і антигеном.

3.2.5. Приготування комплементу.

Кількість комплементу для головного досліду визначають за формулою:

ТхП

Х= ------,

де Х - кількість комплементу, необхідна для головного досліду;

Т - титр комплементу в бактеріологічній системі;

П - кількість пробірок в реакції;

20 - розведення комплементу (1:20).

Наприклад, в досліді 200 пробірок, титр комплементу (згідно табл.2) – 0,1.

Тобто, кількість його для проведення досліду:

0,1х200

----------- = 1,0 см³

Необхідна кількість розведеного комплементу для головного досліду дорівнює 40 см³ (0,2 см³х200). Тобто до 1,0 см³ основного розчину комплементу добавляють 39,0 см³ фізіологічного розчину.

3.3. Проведення головного дослідження.

Сироватки досліджують у розведенні 1:5, 1:10 з антигеном та 1:5 без антигену (визначення антикомплементарності сироватки). При масових дослідженнях допускається постановка реакції в одній пробірці з розведенням сироватки 1:10 з антигеном.

Для дослідження проб в одній пробірці дозаторомберуть 0,02 см³ сироватки і 0,18 см³ фізіологічного розчину.

Для дослідження проб у трьох пробірках в першу наливають 0,1см³ досліджуваної сироватки і додають 0,4 см³ фізіологічного розчину (розведення 1:5). З першої пробірки переносять у другу 0,2 см³ і 0,1 см³ у третю, в яку потім додають 0,1 см³ фізіологічного розчину. Інактивацію сироваток проводять як зазначено у п. 3.2.4.

Таблиця 3

Головне дослідження

При постановці головного дослідження одночасно ставлять такі контролі:

— позитивна сапна і негативна сироватки в тих же розведеннях, що і досліджувані з антигеном і без антигену;

— антиген без сироватки (на антикомплементарність);

— антиген без сироватки і комплемента (на гематоксичність);

— гемолітична система з фізіологічним розчином.

Якщо досліджувані сироватки в одній пробірці (розведення 1:10 з антигеном) дали затримку гемолізу, їх досліджують повторно у трьох пробірках.

3.4. Облік результатів реакції проводять двічі: зразу після останнього прогрівання пробірок у водяній бані і на наступний день після зберігання пробірок при температурі 4–8°С.

Спочатку враховують результати контролів. Якщо в пробірках з позитивною сироваткою і антигеном, з антигеном без сироватки і компліменту, з гемолітичною системою і фізіологічним розчином буде повторна затримка гемолізу, а в пробірках з негативною сироваткою і антигеном, з сапною і негативною сироватками без антигену із антигеном без сироватки - повний гемоліз, постановку реакції вважають правильною і проводять облік результатів.

Реакцію оцінюють за ступенем затримки гемолізу еритроцитів, яку визначають за шкалою, приготовленою перед обліком реакції. Для цього вміст 3–5 пробірок з повним гемолізом зливають в одну, потім гемолізовану рідину і фізіологічний розчин розливають в пробірки за такою схемою (Табл. 4). Відповідно до цієї шкали встановлюють ступінь затримки гемолізу еритроцитів в кожній пробірці.

Таблиця 4

Оцінка реакції зв’язування комплементу

3.5. Реакцію оцінюють в хрестах в залежності від відсотка гемолізованих еритроцитів:

++++ (4 хрести) - повна відсутність гемолізу;

+++ (3 хрести) - гемоліз 25% еритроцитів;

++ (2хрести) - гемоліз 50% еритроцитів;

+ (1хрест) - гемоліз 75% еритроцитів;

- (мінус) - повний гемоліз.

3.6. Діагностичним титром сироватки вважають розведення її 1:10. При затримці гемолізу еритроцитів в цьому розведенні сироватки на ++++ і +++ реакцію вважають позитивною незалежно від результатів реакції з сироваткою в розведенні 1:5. При затримці на ++ і + реакцію вважають сумнівною, якщо затримка гемолізу в розведенні сироватки 1:5 відповідає ++++ або +++.

У всіх інших випадках реакцію вважають негативною.

4. Патологоанатомічні зміни

4.1. Хвороба перебігає з утворенням гранульом в легенях, на слизовій оболонці носової порожнини, гортані, трахеї, на шкірі, в інших органах і тканинах з ураженням лімфатичних вузлів. Гранульоми можуть підлягати розпаду з утворенням виразок.

4.2. При дослідженні оглядають шкіру тварини, розрізають виявлені вузли. Потім труп розтинають без зняття шкіри, оглядають слизові оболонки органів дихання, обстежують легені, печінку, селезінку, лімфатичні вузли голови і інших органів.

4.2.1. На слизових оболонках виявляють вузлики, виразки з червоними краями або рубці, в паренхіматозних органах – світло-сірі вузлики різної величини, при цьому зміни можуть спостерігати одночасно і в регіональних лімфатичних вузлах.

4.2.2. Ураження в легенях можуть бути у вигляді міліарних вузликів, а також у формі дрібних і великих вогнищ (ацинозна, ацинозно-нодозна, лобулярна або лобарна пневмонія), іноді з кавернами. Виявляються також саловидні ділянки склерозу тканин.

Уражені лімфатичні вузли різко збільшені, тверді, можуть містити обезвапнені інкапсульовані вузлики або бути на розрізі однорідними, без малюнка, сіро-білого кольору. Нерідко спостерігається запалення тканин навколо вузла (періаденіт) з утворенням загального щільного фіброзного вузла.

5. Бактеріологічні дослідження

5.1. Бактеріологічна діагностика включає культуральне і біологічне дослідження біоматеріалу. Для дослідження використовують підщелепові, заглоткові, бронхіальні, середостінні лімфатичні вузли, носову перегородку, гортань, глотку, трахею, а також змінені ділянки легень, печінки, селезінки, шкіри з підшкірною клітковиною.

5.2. Культуральні дослідження.

Із біоматеріалу роблять посів за допомогою пастерівської піпетки з грушею або шприца з довгою тонкою голкою (окремою для кожного органу) в МПБ і на МПА з 2–4% - гліцерину (МПГБ, МПГА), рН 6,8–7,0. Посіви інкубують при температурі 37–38°С. Ріст з’являється на 2–4 добу.

При рості збудника бульйон мутніє, на дні з’являється слизовий сіро-білий осад, що піднімається штопором при струшуванні пробірки; деякі штами утворюють пристінкове кільце або плівку на поверхні бульйону.

На агарі збудник сапу росте у вигляді гладких напівпрозорих колоній сірувато-білого кольору з перламутровим відтінком, що зливаються потім в слизовий наліт на поверхні середовища.

Для ідентифікації збудника виділену культуру піддають мікроскопії, мазки забарвлюють по Граму синькою Леффлера (старою) або по Романовському - Гімза, пересівають на картопляне середовище Павловського, знежирене молоко, визначають рухливість у висячій краплі, а також досліджують в реакції аглютинації на склі з сапною сироваткою, взятою в розведенні 1:10.

Збудник сапу являє собою тонкі зернисті грам негативні палички з закругленими кінцями, які розміщаються поодиноко або короткими ланцюжками. При фарбуванні по Романовському - Гімза і синькою Леффлера відмічають добре виражену зернистість.

При вирощуванні на картопляному середовищі Павловського через 2–3 доби з’являються дрібні напівпрозорі з жовтуватим відтінком колонії, які потім зливаються, утворюючи слизовий „вапняний” наліт. Колір нальоту змінюється від янтарно-жовтого в перші 3 доби росту до буро-коричневого і червонуватого до 6–8 доби.

Збудник сапу нерухомий, повільно (на 8–14 добу) скисає молоко. Потрібно відмітити значно виражений броунівський рух клітин збудника у висячій краплі.

Більшість штамів аглютинується сапною сироваткою. Виділену культуру досліджують на біологічні властивості, як вказано нижче.