Читайте также:
|
|
Власне до генної інженерії в повній мірі можна віднести лише перший напрямок досліджень – синтез генів поза організмом. Вперше дослідження з синтезу генів провів Г. Корана у 1967-1969 рр. Об‘єктом була відома послідовність нуклеотидіваланінової т РНК дріжджів. Робота виконана в декілька етапів: 1) одержання однонитчастих дезоксиолігонуклеотидів; 2) одержання двонитчастих фрагментів дезоксиолігонуклеотидів довжиною 8-12 п.п Синтезований ген мав довжину 77 нуклеотидів, але не характеризувався експресією, бо не мав регуляторних ділянок.
В подальшому Г. Корані продовжив дослідження в цьому напрямку, але першість у синтезі повноцінного гену належить Полу Бергу. Він одержав іп vitro першу рекомбінантну ДНК шляхом об‘єднання лінійних фрагментів ДНК з допомогою штучних “липких” кінців. Для синтезу використані: геном онкогенного вірусу мавпи (SV40), частина геному бактеріофага λ (лямбда) і гени лактозного оперону кишкової палички Esckerichia coli. Оскільки ген мав структурну регуляторну частини, він індукував в бактеріальній клітині тваринний гормон сомастатин. Саме дата отримання Бергом першої рекомбінантної ДНК (1972 р.) і вважається початком генної інженерії.
В 1976 році продовжуючи свої дослідження Г. Корані вдалося синтезувати ген тирозинової тРНК кишкової палички. Він складався із структурної частини (126 нуклеотидів), регуляторної (промотора) – 52 нуклеотиди і термінатора – 21 нуклеотид. На відміну від попередніх досліджень цей штучно створений ген мав всі необхідні складові, а тому, коли був введений у бактеріальну клітину функціонував як природний.
До останнього часу хімічним способом створювати штучно великі гени не вдавалося. Запропонований інший метод з використанням ферментативного синтезу за допомогою механізму транскрипції. Він оснований на даних, отриманих вченими Г. Теміна і Д. Балтімора. Вони встановили, що під час репродукції генних РНК - вмісних вірусів, що спричиняють пухлини у тварин, спадкова інформація може передаватися ввід РНК до ДНК. Цей процес відбувається за участю спеціального ферменту – РНК залежна ДНК полімераза або зворотня транскриптаза (ревертаза).
Практично ферментативний синтез здійснюють так. In vitro з використанням зворотньої транскриптази на матричній РНК синтезуються комплементарна їй ДНК (одна нитка). Потім вона подвоюється і стає двонитчастою. Після цього мРНК руйнується рибонуклеазою. Оскільки синтезована ДНК не є такою, що міститься в ядрі, вона називається ДНК - копією (кДНК). Особливість її – відсутність інтрогенів, тобто за структурою вона не відрізняється від бактеріального гена.
Створений таким способом ген може функціонувати у бактеріальній клині. На ньому синтезується мРНК, за кодом якої утворюється білок. Створений під керівництвом В.М. Енгельгарда ген, який введений у фаг, обумовлював синтез галактозидази. Пізніше синтезовані гени, що керують утворенням гемоглобіну людини, кроля, голуба, гени мітохондрій печінки щура тощо. Цим способом також отриманий, клонований їм експресований у клітинах бактерій генів інтерферону людини для боротьби з вірусною інфекцією.
Синтезовані гени з використанням зворотньої транскрипції через відсутність регуляторної частини і промотора не можуть функціонувати в клітинах еукаріотів. Водночас, перенесені в мікробну клітину до них приєднується промотор, добутий з неї, що забезпечує експресію гена. Так були синтезовані гени, які контролюють синтез інсуліну, а в інших дослідах – нітрогормони.
Перспективність ферментативного синтезу генів у можливості транскрибування будь-яких генів з мРНК. Проте відсутність регуляторних генів обмежує і навіть унеможливлює практичне використання таких генів. У них відсутні також інтрониі.
Наступні етапи досліджень, вважаю, відносяться до генетичної інженерії. У 1969 році під керівництвом Дж. Беквіта здійснено вперше виділення гена. Ним був ген лактозного оперону кишкової палочки Escherichia coli. В дослідження залучали два бактеріофаги: λ і φ (фі)80, у яких орієнтація Lac-оперону протилежна відносно власних генів. У фага λ послідовність структурних генів така: a, y, z, o, p, i, а фага φ протилежна – i, p, o, z, y, a. Щоб звільнитися від генів фагів проводили гібридизацію важних ниток ДНК (багатих Г-Ц парами) обох фагів. В результаті комплементарність генів мала місця лише на ділянці lac-оперону. Однонитчасту ДНК, яка знаходилася по обидва боки гібридної ДНК, вирізали специфічною ДНК дезоксирибонуклеазою, виділеною з N.crassa. Таким чином був отриманий lac-оперон у чистому вигляді.
Дата добавления: 2015-04-20; просмотров: 48 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |