Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Біохімічні сенсори

На сьогоднішній день імуноаналіз часто використовують для ідентифікації кокаїну і його метаболітів в біологічних рідинах, але він не може давати надійні кількісні результати, оскільки зазвичай при підтвердженні підозри на вживання кокаїну після імуноаналізу потрібно це підтвердити більш надійним методом [5].

В роботі [16] розробили інтегровану платформу для дуже чутливого методу визначення кокаїну на основі рефрактометричного біосенсору.

Принцип роботи сенсору полягає в тому, що за нормальних умов тиск парів кокаїну складає близько 1,9*10^-7 тор (чи 2,5*10^-5 Па) і тому існує можливість визначення кокаїну в повітрі при прокачуванні кількох мл повітря через певну установку, в якій кокаїн із газової фази переходить в рідку (50 мкл), а при подальшому визначення межа виявлення складає кілька нМ. Система використовує біосенсору фільтру мод (типів хвиль) на решітці у хвилеводі, функціаналізований з мультивалентними антигенами, зв’язаних із протеїнами та спряженими кон’югатами. Схема імуноаналізу складається з конкурентного зв’язування специфічних кокаїнових антитіл з іммобізованими кон’югатами. Визначення кокаїну базується на зміні ефективного показника заломлення світла хвилеводу при адсорбції біомолекул (рис. 17).

Рис. 17. Схематичне зображення біосенсору фільтру мод (типів хвиль) на решітці у хвилеводі.

Чіп хвилеводу складається із тонкої плівки Ta₂O₅, нанесеної на скляну підложку. Кожен чіп складається із 3 колонок, що містять по 8 вхідних решіток, сигнал кожної з яких можна виміряти індивідуально. Поверхня кожної функціаналізованої вхідної решітки складає 0,8 мм² і проточна комірка спроектована так, що забезпечує циркуляцію розчину на всі 8 каналів одночасно. Світловий промінь, згенерований лазерним діодом при 763 нм, сфокусований і падає на чіп. Світло потрапляє на хвилевід через решітку. Світло в хвилеводі «відчуває» присутність біомолекул внаслідок неоднорідності поля, і потім розділяється іншою решіткою перед тим, як буде безпосередньо зафіксоване. Резонансну довжину хвилі знаходять налаштуванням довжини хвилі емісії джерела світла (лазера). Мультивалентні антигени на кокаїн закріплювали на хвилеводі за допомогою спеціальної технології OptoDex^®, розробленої Arrayon Biotechnology.

Поряд з оптимізацією умов аналізу, спрощенням пробопідготовки, налаштування сенсору оптимізовані для ідентифікації наркотичних речовин та автоматичного відбору проб. Автоматизація системи полягала у зборі комерційних компонентів обробки рідини, спроектованих і виготовлених проточних комірках і розробці загального програмного забезпечення для всього девайсу (рис. 18). Рідинна система була розроблена для одночасної обробки 6-ти зразків. Її легко можна сполучити із системою для пробопідготовки, що вловлює кокаїн із повітря і розчиняє його у спеціальному розчиннику. Зразки за допомогою поршневого насосу закачували в систему індивідуально (тобто кожен окремо) через 6-типортовий розподільчий клапан. Петлевий дозатор об’ємом 50 мкл, заповнений досліджуваним зразком, поміщали в кран-дозатор. Завдяки точному дозуванню об’ємів поршневим насосом за допомогою шприців невеликого об’єму (50 – 250 мкл), мертвий об’єм теж був мінімальним. Мінімальний об’єм зразку, що повністю і відтворювано заповнить петлевий дозатор на 50 мкл, становить 85 мкл. Це значення можна ще зменшити в подальшому, якщо використовувати ще менший об’єм дозатору. Рухомою фазою є рідина PBS (фосфатний буфер, рН 7,4). Вона вводиться другий поршневим насосом. Оптична проточна комірка складається із полімерного корпусу, в який включений чіп хвилеводу.

Рис. 18. Схема повністю укомплектованого біосенсору включаючи систему подачі рухомої фази, власне біосенсор та оптичну проточну та Z-подібну абсорбційну комірку; А – фото сенсору, В – схематичне зображення.

1000-кратне посилення чутливості сенсору досягається при використанні кон’югованих золотом (40 - 70 нм) антитіл замість чистих антитіл. При цьому таку систему поміщають на шляху другого променя в іншій проточній оптичній комірці. Z-подібну абсорбційну комірку розміщуєть після проточної, яка виконує функції основного зондування. Поглинання світла в циліндричному каналі (довжина шляху 20 мм) вимірюється при двох різних довжинах хвиль – 530 нм і 860 нм. При 530 нм сильною абсорбцію мають наночастинки золота, тому абсорбція зеленого світла пропорційна концентрації золота, зв’язаного із антигенами, в той час як світло майже інфрачервоного діапазону використовується для порівняння. Вся система контролюється програмний забезпеченням LabVIEW.

Система може працювати в двох режимах: послідовний аналіз до 6-ти зразків чи напівнеперервний пробо відбір для моніторингу. Під час типового експерименту швидкість потоку регулюється автоматично, щоб скоротити час для повного аналізу. Наприклад, промивання зразком здійснюється на високій швидкості, в той час як абсорбція світла фіксується при значно повільніших потоках (10 мкл/хв).

Рис. 19. Схема конкурентного імуноаналізу при визначенні кокаїну із використанням моно канальних антитіл (А) та антитіл, конюгованих золотом (В). Мультивалентні антиген-протеїнові кон’югати іммобілізовані на хвилеводі за допомогою полісахариду OptoDex.

Як показано на рис. 19, визначення проводили за допомогою схеми конкурентного зв’язування. Зразок, що містив кокаїн, змішували із точною кількістю моноканальних антитіл на кокаїн (mAb) і вводили в проточну комірку. Антитіла зв’язувались або із вільним кокаїном в розчині, або з його аналогами, присутніми на поверхні зв’язаних білків-носіїв. Коли концентрація вільного кокаїну зростає, менше антитіл може зв’язатись із поверхнею. Таким чином, аналітичний відгук зменшується, коли в пробі наявний кокаїн.

Результати, отримані в оптимальних умовах, показують, що при використанні антитіл, конюгованих золотом, робочий діапазон аналізу змістився в сторону нижчих концентрацій кокаїну (рис. 20).

Рис. 20. Градуювальні графіки конкурентного імуноаналізу, проведеного за допомогою моноканальних антитіл mAb (вільні трикутники) і кон’югованих золотом Au-mAb (заповнені трикутники).

Похибка визначення становила близько 5% для одного сигналу. На основі градуювальник кривих встановили такі параметри: межа виявлення (3σ) кокаїну становила 0,2 нг/мл (0,7 нМ) для Au-mAb і 0,26 мкг/мл (0,85 мкМ) для mAb. Результати визначень показали, що в рідкій пробі кокаїн можна визначити аж від концентрації 0,7 нМ протягом 1 хв. Цю межу можна ще знизити, коли використовувати довший час зв’язування; при цьому межа виявлення знижується до 0,2 нМ, та значно зростає час аналізу – до 15 хв. Обговорюється використання даного сенсору в пунктах контролю аеропортів.

Таблиця 4

Порівняльна характеристика розглянутих сучасних методів визначення кокаїну

Висновки:

· Імнуноферментний аналіз є значно дешевшим, ніж ГХ-МС та ВЕРХ-МС, але при цьому він менш чутливий і селективний. Не потребують складної пробопідготовки і забезпечують швидкий аналіз автоматизовані біосенсори, що може проводитись і неспеціалістом. Їх недолік – працюють лише для певного об’єкту.

· Покращити як чутливість, так і селективність можна використанням ВЕРХ-МС. ВЕРХ має деякі переваги перед ГХ, наприклад, аналіз без попередньої дериватизації. Але за рахунок складнішої техніки виконання та потреби у великій кількості високочистих розчинників, ВЕРХ є дорожчим методом за ГХ.

· ГХ-МС характеризується високою чутливістю та специфічністю. ГХ для аналізу вищеназваних зразків з кокаїном потребує трудомісткої та складної пробопідготовки, що робить аналіз більш тривалим, дорожчим і створює труднощі при дослідженні великої кількості зразків.

· Використання мас-спектроскопії окремо та як детектору у хроматографії має значну перевагу – відсутність потреби у стандартах для аналізу, оскільки ідентифікація здійснюється безпосередньо за мас-спектрами. Недолік – висока вартість обладнання, потреба у висококваліфікованих спеціалістах.

· Вольтамперометричне визначення кокаїну значно залежить від умов спонтанного гідролізу, оскільки електроактивним є метаболіт кокаїну – бензилекгонін, утворення якого залеить від кислотності середовища, а не сам наркотик. Вартість обладнання значно нижча, ніж для ГХ і ВЕРХ, особливо з мас-детекторами.

Список використаної літератури:

1. А.П. Орехов Химия алкалоидов / А.П. Орехов, Р.А. Коновалова, А.А. Коновалова. – М.: Издательство академии наук СССР. – 1955. – 868 с.

2. Н.В. Веселовская Наркотики. Свойства, Действие, Фармакокинетика, Метаболизм. Пособие для работников наркологических больниц, наркодиспансеров, химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий / Н.В. Веселовская, А. Е. Коваленко — М.: Триада-Х, 2000. — 196 с. - С. 83 - 87.

3. Russell J. Lewis Determination of cocaine, its metabolites, pyrolysis products, and ethanol adducts in postmortem fluids and tissues using Zymark® automated solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry / Russell J. Lewis, R.D. Johnson, M.K. Angier [etc.]. - Journal of Chromatography B. – Volume 806. – 2004. – p. 141–150.

4. Thomas Berg Determination of opiates and cocaine in urine by high pH mobile phase reversed phase UPLC–MS/MS / Thomas Berga, Elsa Lundanesb, Asbjørg S. Christophersen [etc.]. - Journal of Chromatography B. – Volume 877. – 2009. – p. 421–432.

5. M.R. Brunetto Determination of cocaine and benzoylecgonine by direct injection of human urine into a column-switching liquid chromatography system with diode-array detection / M.R. Brunettoa, Y. Delgado Cayamaa, L. Gutiеerrez Garcіa [etc.]. - Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. – Volume 37. – 2005. – p. 115–120.

6. Fang Ma Determination of cocaine and its metabolites in serum microsamples by high-performance liquid chromatography and its application to pharmacokinetics in rats / Fang Ma, Jun Zhang, Chyan E. Lau. - Journal of Chromatography B. – Volume 693. – 1997. – p. 307 – 312.

7. Kjell A. Mortier Simultaneous, quantitative determination of opiates, amphetamines, cocaine and benzoylecgonine in oral fluid by liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry / Kjell A. Mortier, Kristof E. Maudens, Willy E. Lambert [etc.]. - Journal of Chromatography B. – Volume 799. – 2002. – p. 321 – 330.

8. Martha Mıguez-Framil Improvements on Enzymatic Hydrolysis of Human Hair for Illicit Drug Determination by Gas Chromatography/Mass Spectrometry / Martha Mıguez-Framil, Antonio Moreda-Pineiro, Pilar Bermejo-Barrera [etc.]. – Anal. Chem. – Volume 79. – 2007. – p. 8564 – 8570.

9. Fernanda Crossi Pereira de Toledo Determination of cocaine, benzoylecgonine and cocaethylene in human hair by solid-phase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry / Fernanda Crossi Pereira de Toledo, Mauricio Yonamine, Regina Lucia de Moraes Moreau [etc.]. - Journal of Chromatography B. – Volume 798. – 2003. – p. 361 – 365.

10. Katrin Lachenmeier Determination of opiates and cocaine in hair using automated enzyme immunoassay screening methodologies followed by gas chromatographic–mass spectrometric (GC–MS) confirmation / Katrin Lachenmeier, Frank Musshoff, Burkhard Madea. - Forensic Science International. – Volumr 159. – 2006. – p. 189 – 199.

11. S. Armenta Analytical methods to determine cocaine contamination of banknot from around the world / S. Armenta, M. de la Guardia. – Trends in Analytical Chemistry. – Volume 27. – 2008. – p. 344 – 351.

12. Daniela-Saveta Popa Determination of cocaine and benzoylecgonine in human plasma by LC-MS/MS / Daniela-Saveta Popa, Laurian Vlase, Sorin E. Leucuta [etc.]. – Farmacia. – Volume 57. – 2009. – p. 301 – 308.

13. Lei Sun High-performance liquid chromatographic determination of cocaine and its metabolites in serum microsamples with fluorimetric detection and its application to pharmacokinetics in rats / Lei Sun, Gene Hall, Chyan E. Lau. - Journal of Chromatography B. – Volume 745. – 2000. – p. 315 – 323.

14. Valentina Pavlova Studying electrode mechanism and analytical determination of cocaine and its metabolites at the mercury electrode using square-wave voltammetrу / Valentina Pavlova, Valentin Mirеceski, Šebojka Komorsky-Lovriеc [etc.]. – Analytica Chimica Acta. – Volume 512. – 2004. – p. 49 – 56.

15. Martha Míguez-Framil Electrospray ionization tandem mass spectrometry for the simultaneous determination of opiates and cocaine in human hair / Martha Míguez-Framil, Antonio Moreda-Pineiro, Pilar Bermejo-Barrera [etc.]. – Analytica Chimica Acta. – Volume 704. – 2011. – p. 123 – 132.