|
Соединения | Продукт гидролиза | Значения (подвижная фаза -бензол) | УФ- спектры (λв нм) |
Нитразепам | 2-амино-5-нитробензофенон 2,5-диаминобензофенон | 0,17-0,18 старт | 238, 358 |
Феназепам | 2-амино-5-хлор-бромбензофенон | 0,43-0,45 | 230, 400 |
Диазепам | 2-метиламино-5-хлорбензофенон (МХБ) 2-амино-5-хлорбензофенон | 0,57 0,35-0,37 | 238.410 238, 390 |
Хлордиазепоксид | 2-амино-5-хлорбензофенон | 0,35-0,37 | 238, 390 |
4.1 Количественное оп ределение хлордиазепоксид а. В зависимости от концентрации 2-амино-5-хлорбензофенона, которую ориентировочно рассчитывают после снятия спектра в УФ, отбирают часть элюата () ипереносят в бюкс. Этанол удаляют под током теплого воздуха сухой остаток растворяют в 0,2-0,5 мл этанола и добавляют до 3 мл 2 н. раствора НСl. Далее последовательно - 0,5 мл 0,1 % раствора нитрита натрия, через 5 минут - 0,5 мл 0,5 % раствора сульфамата аммония. После добавления каждого реагента раствор интенсивно взбалтывают. Азокраситель сиреневого света образуется через 15 минут после добавления 1 мл 0,1 % раствора N-L-нафтилэтилендиаминдихлорида. Окраска устойчива в течение суток.
Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при 550 нм в кювете 1 см.
Концентрацию хлордиазепоксида в органах определяют по формуле
X = Dx V1 x V3 x 100 / x m x V2 x V4
где х - количество выделенного соединения в мг на 100 г органов,
D - оптическая плотность измеряемого раствора.
- удельный показатель поглощения (220).
Другие буквенные обозначения указаны в тексте.
Опр еделение удельного показателя погл о щения. В три калиброванные мерные пробирки (для трех повторных определений) на 5 мл вносят по 0,1 мл (100 мкг) стандартного спиртового раствора хлордиазепоксида (1 мг/мл), добавляют по 3 мл 2 н. раствора соляной кислоты и гидролизуют в течение 30 минут на глицериновой бане при 125-135°C с обратным холодильником. По окончании гидролиза холодильник промывают 1 мл 2 н. раствора соляной кислоты и после охлаждения гидролизата доводят последний до 5 мл.
Из каждого гидролизата в мерные пробирки вносят по 0,1; 0,25;0,50, 0,75; 1 мл (2, 5, 10, 15, 20 мкг вещества), доводят 2 н. раствором соляной кислоты до 3 мл и проводят реакцию образования азокрасителя как указано выше. После определения плотности окрашенного раствора при 550 нм удельный показатель поглощения вычисляют по формуле:
Формула = D x / C x 1 (220).
где, D - оптическая плотность раствора;
- удельный показатель поглощения (220).
С - концентрация раствора в весовых процентах;
1 - толщина поглощающего слоя в см;
В качестве раствора сравнения используют смесь реактивов. Подчинение закону Бугера наблюдается в пределах концентрации 5-20 мкг в исследуемой пробе. (Определение содержания хлордиазепоксида по бензофенону, основанное на получении азокрасителя с β-нафтолом, проводить нельзя ввиду отсутствия характерного спектра поглощения).
Исследование по нативному соединению с метаболитами (этап 2). Объектами исследования на содержание хлордиазепоксида совместно с метаболитами являются печень, стенки желудка и кишечник.
Методика анализа.
1.Изоли рова ние. 25 г мелко измельченных органов (средняя проба из 100 г) заливают в стакане емкостью 200 мл 0,5 н. раствором соляной кислоты (рН=1,0) и оставляют при комнатной температуре в течение часа, периодически перемешивая и проверяя значение рН среды. Настаивание повторяют 2 раза при тех же условиях. Извлечения объединяют, процеживают через тонкий тампон в делительную воронку на 250 мл и устанавливают рН=3,0 по универсальному индикатору Экстрагируют хлороформом трижды по 15 мл. В случае образования эмульсии разделение фаз достигалось центрифугированием извлечения в течение 10 минут при 5000 об/мин. Органическую фазу переносят в мерную колбу на 50 мл, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия, доводят хлороформом до метки и перемешивают. Извлечение исследуют на содержание хлордиазепоксида и метаболитов: демоксепама, десметилхлордиазепоксида и дезоксидемоксепама
2. Хроматографическое исследование. На стартовую линию хроматографической пластинки со стандартным слоем силикагеля КСК, закреп-
ленного гипсом, наносят остаток 1/5 части извлечения, растворенный в
минимальном количестве хлороформа. На расстоянии 2 см от первой точ-
ки наносят в виде полос 1 см этанольные растворы (1 мг/мл) хлордиазепоксида и его метаболитов: демоксепама. десметилхлордиазепоксида, дезоксидемоксепама. Хроматографируют в камере, насыщенной системой растворителей этилацетат - абсолютный этанол (9:1). Пробег растворителя 10 см. По удалении растворителя с сорбента хроматографическую пластинку обрабатывают концентрированной НС1 до полного увлажнения слоя силикагеля. Накрывают покровным стеклом, избегая прилипания влажного сорбента к покровному стеклу. и термостатируют при
135-140°С. По истечении 20 минут покровное стекло снимают, а хроматограмму оставляют в термостате еще на 5 минут. После охлаждения пластинкн слой сорбента обрабатывают последовательно реагентами для образования азокрасителя. При наличии хлордиазепоксида и его метаболитов образуются пятна сиреневого цвета, значения которых представ-
лены в таблице 4.
Одновременно с первой хроматографичеcкой пластинкой в эту же
камеру помещают вторую, на стартовую линию которой наносят полосой 1,5 см остатки из 2/5 и 1/5 части извлечений. В третью полосу длиной 1см, наносят в качестве метчика смесь стандартных растворов (1 мг/мл) хлордиазепоксида и его метаболитов. После поднятия растворителя на 10 см и удаления его с силикагеля под током теплого
воздуха, зону сорбента, соответствующую 2/5 извлечения, фиксируют
стеклянной пластинкой. Остальную часть хроматограммы обрабатывают последовательно реактивом Драгендорфа (модификация Hachebout) и 10 % раствором Н2SO4. При наличии хлордиазепоксида и его метаболитов наблюдаются пятна оранжево-красного цвета. Зону cорбента, соответствующую 2/5 части извлечения, параллельную проявленным пятнам, снимают, помещают на стеклянный фильтр (№ 4) и элюируют ацетоном дважды по 5 мл в мерную пробирку.
3. Фо томе трия в УФ-обла сти спектра. В полученных элюатах удаляют органический растворитель, сухие остатки растворяют в 5 мл этанола и снимают спектры поглощения в УФ-области в интервале длин волн 200-400 нм, раствор сравнения - 96°С этанол. Измерение в тех же условиях повторяют после добавления в кювету, включая и раствор сравнения, по 3 капли насыщенного раствора NаОН. После снятия спектра в щелочной среде в те же кюветы добавляют по 5 капель концентрированной Н2SO4, и получают спектр в кислой среде. Характер полос поглощения хлордиазепоксида и его метаболитов в различных средах представлен в таблице 4
4. Хроматографическая очистка. При отсутствии характерных спектров соединений по причине влияния эндогенных веществ необходимо удалить последние, используя хроматографирование полученных элюатов в метаноле. Спиртовые растворы элюатов после снятия спектров упаривают и сухие остатки наносят на стартовую линию хроматографической пластинки полосой 1 см. Рядом наносят 1 /5 часть хлороформного извлечения. Хроматографируют в камере, насыщенной в течение 15 минут метанолом, до поднятия растворителя на 10 см. После удаления растворителя под током теплого воздуха зону сорбента, соответствующую 1/5 части извлечения, обрабатывают реактивом Драгендорфа и 10 % раствором Н2SO4. Параллельно проявленным пятнам снимают сорбент в зоне расположения нанесенного элюата. Помещают на стеклянный фильтр № 4 иэлюируют дважды по 5 мл ацетоном (время настаивания по 10 минут).
При исследовании хлордиазепоксида по 2-амино-5-хлорбензофенону определяется 60,5±4,3%-70,0±1,2% от введенного количества. Такой интервал определяемых концентраций зависит от характера анализируемого объекта: степень извлечения значительно снижается при наличии эндогенных соединений липоидной структуры.
При исследовании по неизмененному соединению и метаболитам
степень извлечения хлордиазепоксида и его метаболитов находится в
интервале от 55±2,2% до 62±2,8%.
12.2. Селективность метода исследования хлордиазепоксида.
Селективность анализа хлордиазепоксида по продукту гидролиза 2-амино-5-хлорбензофенону установлена по отношению к лекарственным соединениям, указанным в таблице 7.5, что надо учитывать при подозрений комбинированного отравления.
Таблица 4
ЗначенияRf и спектральные характеристики хлордиазепоксида и его метаболитов.
Вещества | Значения Rf (система этилацетат - абс. спирт (9:1) | УФ-спектры (λ внм) | ||||
спирт | кислота | щелочь | ||||
хлордиазспоксид | 0.32 | |||||
Демоксепам | 0,62 | |||||
ДесметилХлордиазепоксид | 0,20 | |||||
дезоксидемокспам | 0.75 | |||||
Таблица 5.
Значение Rf лекарственных препаратов, имеющих аромати ческую аминогруппу, в системе растворителей этилацетат - абсолютный спирт (9:1)
Соединение | В вытяжке из раствора | |
кислого | щелочного | |
Оксазепам | 0,70 | 0,70 |
Диазепам | 0,78 | 0.78 |
Нитразепам | 0.76 | 0.76 |
Анестезин | — | 0,93 |
Стрептоцид | 0,70 | 0.70 |
Сульгин | 0,30; 0,85 | 0,30 |
Су льфадиметоксин | 0,82 | 0.82 |
Сульфадимезин | — | 0.2,0, 0.70 |
Этанол | 0,65 | — |
Парааминобензойная кислота Парааминосалицидовая кислота | 0,82 0,85 | — |
Производные 1,4-бензодиазепина в сочетании с метаболитами осложняют проведение анализа в этом направлении. Однако следует упомянуть, что метаболиты оксазепама (в основном глюкурониды) не экстрагируются хлороформом из водного извлечения, переходит в органическую фазу только нативное соединение. Отсюда следует, что при наличии оксазепама, в отличие от хлордиазепоксида, на хроматограмме появляется лишь одно окрашенное пятно, Rf которого =0,70 ÷0.72. В данном случае это немаловажный факт, т.к. селективность анализа при исследовании хлордиазепоксида по бензофенону отсутствует в отношении оксазепама.
Обнаружение хлордиазепоксида в объектах, подвергшихся различной степени гнилостного разложению, при исследовании по продукту гидролиза (АХБ) не вызывает затруднений. 70-85 % хлордиазепоксида удается обнаружить при хранении объектов в течение года.
Отрицательное влияние продуктов гнилостного разложения обьектов при исследовании неизмененного хлордиазепоксида и его метаболитов (II этап) проявляется через 3 недели с момента наступления смерти. При более поздних сроках хранения исследование сводится к анализу продукта гидролиза - 2-амино-5-хлорбензофенона (1 этап). В случае обнаружения последнего эксперт в своем заключении указывает на присутствие в объектах исследования производных 1,4-бензодиазепина, продуктом гидролиза которых может быть 2-амино-5-хлорбензофенон.
Дата добавления: 2015-01-30; просмотров: 49 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |