Студопедия  
Главная страница | Контакты | Случайная страница

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Криоконсервация тканей или клеточных культур растений

Читайте также:
  1. D) Отечественная культура в условиях тоталитарного общества.
  2. I. Исследование клеточных факторов неспецифической резистентности.
  3. I. История применения лекарственных растений. Заготовка, сбор, сушка и хранение лекарственных растений
  4. II. Культурный старт.
  5. II. Правовая культура: понятие, функции и виды.
  6. II. Предмет, задачи физиологии растений
  7. II. Система культуры и её структура.
  8. II. Советский период развития отечественной культуры (1917-1991 гг.)
  9. II. ФИЗИОЛОГИЯ ВОЗБУДИМЫХ ТКАНЕЙ
  10. III Санкт-Петербургского международного культурного форума

 

Криоконсервация – сохранение биологических объектов в замороженном состоянии при сверх низких температурах (чаще всего при -196оС в жидком азоте) с возможностью восстановления их функций после размораживания. В принципе, с помощью этого метода они могут храниться бесконечно долго, так как сверхнизкие температуры полностью останавливают биохимические процессы в клетках. Криоконсервация нашла широкое применение для хранения культур микроорганизмов, некоторых животных объектов. В частности, невозможно представить современное животноводство без использования для осеменения спермы животных-производителей, которую сохраняют в жидком азоте. Также разработаны методы криоконсервации клеток и тканей растений. Первоначально их применяли для хранения клеточных линий-продуцентов вторичных метаболитов. Позднее появились методы сохранения апикальных меристем, молодых зародышей и соматических эмбриоидов, использование которых дает возможность эффективно поддерживать генетические коллекции.

Низкотемпературное воздействие является смертельно опасным для живых организмов, поскольку способно вызывать необратимые повреждения клеток. Во-первых, образующиеся при быстром понижении температуры кристаллы льда повреждают клеточные органеллы и сами клетки. Во-вторых, при охлаждении клетки могут потерять 80-90% содержащейся в них воды, что приводит к повышению концентрации внутриклеточных растворов до токсического уровня, разрушению гидратированных комплексов макромолекул, к потере активности биополимеров из-за изменения их третичной и четвертичной структуры.

Разработан ряд методических подходов, применение которых обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток при замораживании. Прежде всего, большое значение имеет выбор биологического объекта для криоконсервации. Мелкие, богатые цитоплазмой меристематические клетки растений лучше переносят замораживание, чем крупные, сильно вакуолизированные клетки. В связи с этим для криосохранения клеточных линий продуцентов ВМ суспензии перед замораживанием необходимо часто субкультивировать, отбирать клетки для замораживания в позднюю лаг-фазу или в начале экспоненциального роста.

Большое значение для успеха криконсервации имеет использование криопротекторов – веществ, защищающих клетки от повреждений при замораживании. Существует большое количество веществ, обладающих криопротекторными свойствами, однако на практике используют лишь некоторые из них. Различают криопротекторы двух типов: проникающие внутрь клетки и непроникающие. Проникающие протекторы (глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксид (ДМСО), аминокислоты: пролин, аспарагин и другие) препятствуют формированию кристаллов льда путем образования водородных связей с молекулами воды. Непроникающие криопротекторы (сахароза, трегалоза, фиколл, альбумин, поливинилпирролидон), как полагают, защищают клетки от осмотических перепадов, связанных с замораживанием, снижают скорость роста кристаллов льда. Непроникающие криопротекторы обычно являются дополнительными компонентами в растворах проникающих криопротекторов.

Эффективность криоконсервации можно повысить путем прекультивирования подлежащих замораживанию объектов в специфических условиях, позволяющих уменьшить содержание воды в клетках. Так, положительный эффект дает прекультивирование в течение нескольких дней пробирочных растений, апикальные меристемы которых предполагается использовать для криосохранения, на питательных средах, содержащих 2-6% маннита или сорбита, ДМСО (2,5-10%), при пониженных температурах (4-6оС).

Радикальное снижение содержания внутриклеточной воды до минимума достигается при использовании высушивания объектов замораживания в ламинарном потоке воздуха, с использованием силикагеля. Этот прием применяют для криоконсервации соматических эмбриоидов и стеблевых меристем, сегментов культуры «бородатого корня». Особенно эффективен он в сочетании с альгинатной инкапсуляцией (encapsulation/dehydration technique). Меристемы или эмбриоиды, заключенные в капсулы из альгината кальция инкубируют в питательной среде, содержащей 0,85 М сахарозы 4-16 час, подсушивают 3-4 час в ламинарном потоке воздуха, затем погружают в жидкий азот. Как видим, в качестве единственного криопротектора используется сахароза – одно из наименее токсичных веществ, обладающих криопротекторными свойствами.

Процесс криоконсервации клеток и тканей растений включает следующие этапы: замораживание, хранение, размораживание, рекультивирование. Подготовленные к замораживанию объекты (путем прекультивирования, высушивания, инкапсуляции/дегидратации) обрабатывают, при необходимости, криопротекторами, затем фасуют в стерильные полипропиленовые пробирки с завинчивающимися крышками объемом 1-2 мл и подвергают замораживанию. Хотя в отдельных случаях возможно непосредственное погружение материала в жидкий азот, обычно применяют замораживание по специальной программе. Температуру понижают медленно (0,5-1оС в минуту) до -35оС, выдерживают при этой температуре 15-30 мин и только после этого погружают материал в жидкий азот. Программируемое охлаждение проводят в специальных аппаратах заводского производства.

Хранение материала осуществляют в сосудах, холодильниках для жидкого азота, оборудованных приспособлениями для размещения пробирок в определенном порядке, чтобы была возможность, при необходимости, быстро найти и извлечь нужный образец. Пробирки должны быть постоянно в погруженном в жидкий азот состоянии. Так как происходит его испарение, необходимо регулярное (обычно раз в неделю) доливание азота.

Размораживание материала по завершении хранения, в отличие от замораживания, осуществляют быстро, помещая извлеченные из жидкого азота пробирки на водяную баню, нагретую до +37-40оС. Быстрое размораживание позволяет избежать образования кристаллов льда внутри клеток, которое может происходить при постепенном повышении температуры. Пробирка объемом 1 мл размораживается за 0,5-1 минуты. После этого культуры отмывают от криопротекторов (многие из них токсичны), используя питательную среду или 3-10% раствор сахарозы, и помещают на питательную среду для возобновления роста. Суспензии клеток после криоконсервации высевают на агаризованную питательную среду, затем образовавшийся каллюс ресуспендируют в жидкой питательной среде. Зародыши, эмбриоиды, апикальные меристемы помещают на агаризованную питательную среду, содержащую небольшое количество цитокининов и гиббереллина, на которой происходит регенерация проростков, пригодных для последующего клонирования. Аналогично поступают с инкапсулированными зародышами, соматическими эмбриоидами.

Ниже приведен в качестве примера протокол криоконсервации суспензионной культуры клеток кукурузы по Withers, King (1979).

1. Активно растущую суспензионную культуру клеток пассируют на питательную среду с 10% пролина.

2. Через 3-4 дня промывают клетки в среде без пролина, затем ресуспендируют в свежей питательной среде.

3. Охлаждают суспензию на ледяной бане, добавляют равный объем охлажденной питательной среды, содержащей 20% пролина (постепенно, в 4 приема в течение 1 часа).

4. Переносят по 1 мл суспензии в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 2 мл с завинчивающимися крышками.

5. Помешают пробирки в аппарат для контролируемого снижения температуры и охлаждают их до -30оС со скоростью 1 градус в минуту.

6. Погружают пробирки в жидкий азот, в котором осуществляют хранение культур.

7. Размораживание пробирок проводят на водяной бане при 40оС в течение 1-2 мин.

8. Размороженную суспензию высевают на агаризованную питательную среду для восстановления роста культуры.

Аналогичная процедура применяется для криоконсервации стеблевых апексов, только при прекультивировании вместо пролина используют ДМСО (около 10%).

 

 

Заключение

Современные технологии клонального размножения растений in vitro обеспечивают очень высокий коэффициент размножения. Большим их преимуществом является то, что с их помощью можно эффективно размножать те растения, которые с трудом размножаются традиционными методами. Все работы можно проводить круглогодично, для их проведения не требуются большие площади. Особенно важно, что при размножении растений в пробирках не возникает угрозы их повторного заражения вирусными и другими болезнями (при условии, что исходное маточное растение является здоровым). В целом, применение технологий клонального размножения растений in vitro экономически более выгодно по сравнению с традиционными технологиями вегетативного размножения, дает возможность получать семенной материал более высокого качества.

Стеблевые меристемы являются наиболее подходящим эксплантатом для введения предназначенных к вегетативному размножению растений в культуру in vitro, поскольку в наибольшей степени обеспечивают сохранение генотипа маточного растения и возможность получения здоровых растений. В отличие от клеток специализированных тканей, инициальные клетки апикальных меристем характеризуются высокой цитогенетической стабильностью: на протяжении всей жизни растения они сохраняют генотип зиготы. Другое важное свойство меристемных тканей – отсутствие в них или крайне низкие концентрации вирусных частиц даже у пораженных вирусами растений.

В 1952 г. Морель и Мартэн (Morel, Martin, 1952) разработали методику оздоровления растений георгинов с помощью культуры in vitro апикальных меристем размером около 100 μм. С тех пор этот метод с разной степенью эффективности нашел применение для широкого круга вегетативно размножаемых растений. Было установлено, что культура меристем позволяет оздоровить растения не только от вирусов, но и бактериальной, грибной инфекции, вироидов и микоплазм.

Для повышения эффективности оздоровления от вирусной инфекции с помощью культуры меристем маточные растения перед вычленением эксплантатов подвергают термотерапии - продолжительному (5-15 нед.) воздействию повышенных температур (37°С, относительная влажность 90 %; освещенность растений около 5 тыс. люкс, фотопериод 16 час) или хемотерапии - добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, различных веществ, обладающих противовирусной активностью. Чаще всего для целей хемотерапии используют синтетические аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований: цианогуанозин, 2-тиоурацил, Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-карбоксимида (коммерческое название – вирозол), а также интерферон, ридостин (рибонуклеат натрия), биназу (микробную рибонуклеазу), фенолкарбоновые кислоты: салициловую, галловую, сиреневую, кофейную, феруловую, кумаровую.

На практике используют следующие методы клонального размножения растений in vitro:

- активация развития уже существующих меристем (апекса стебля, пазушных и спящих почек стебля);

- индукция адвентивных почек у эксплантата или в каллюсной культуре;

- соматический эмбриогенез.

Активация развития уже существующих в растении меристем основана на снятии апикального доминирования у пробирочных растений путем удаления верхушечной почки или добавления в питательную среду цитокининов. По сравнению с другими методами микроразмножения этот метод в наибольшей степени обеспечивает сохранение генотипа исходного маточного растения, так как полученные клоны происходят непосредственно из меристематических клеток, для которых характерна высокая цитогенетическая стабильность.

Метод клонального размножения растений in vitro путем индукции адвентивных почек основан на свойстве тотипотентности растительной клетки. Суть его заключается в том, что эксплантаты разных частей и органов растений, не содержащие стеблевых почек, способны их образовывать in vitro при наличии факторов, индуцирующих стеблевой органогенез, прежде всего соответствующих регуляторов роста. В качестве эксплантатов могут быть сегменты листовых пластинок и черешков, молодых соцветий, чешуй и донца луковиц, клубнелуковиц, корневые черенки, боковые и интеркалярные меристемы и другие органы и ткани.

Адвентивные стеблевые почки могут образовываться и в каллюсной культуре in vitro (стеблевой органогенез). Быстро растущие каллюсные культуры, сохраняющие высокую способность к органогенезу, дают дополнительные возможности для ускорения микроразмножения. Однако генетическая нестабильность каллюсных клеток может приводить к получению растений-регенерантов, имеющих существенные генетические отличия от исходного маточного растения (сомаклональная изменчивость).

Все сказанное относится и к методу клонального размножения растений in vitro, основанному на индукции соматического эмбриогенеза из тканей эксплантата или каллюсных клеток в суспензионной культуре. Тем не менее, отдельные положительные характеристики метода выводят его в число наиболее перспективных. Технологии массового получения соматических эмбриоидов и их адаптации к условиям ex vitro разработаны для ряда важных культур. Эти технологии включают, среди прочего, возможность использования биореакторов и механизированное производство искусственных семян путем инкапсуляции эмбриоидов, благодаря чему появляется возможность существенно уменьшить трудозатраты (как при размножении, так и переносе растений в условия ex vitro) и стоимость продукции.

Особенности микроклимата при выращивании пробирочных растений способствуют появлению у них структурных и физиологических характеристик, сильно затрудняющих выживание в условиях ex vitro. Нередко после пересадки в грунт наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений, прежде всего, из-за нарушения водного баланса. Разработан ряд методических приемов, позволяющих улучшить приживаемость растений. Прекультивирование перед высадкой пробирочных растений в грунт включает использование более бедных по составу минеральных солей питательных сред с пониженным содержанием сахарозы, без цитокининов, эффективной является добавка в питательную среду ретардантов роста, адаптогенов. Повышают интенсивность освещения культур (до 8-10 тыс. люкс) и понижают температуру, при которой производят культивирование, добиваются снижения влажности воздуха в культуральных сосудах путем использования десикантов, охлаждения нижней части сосудов, а также простым удалением пробок из пробирок за 7-10 дней до высадки растений в грунт. Для ряда древесных культур благоприятный эффект дает микоризация пробирочных растений. После высадки растений поддерживают оптимальную температуру, создают высокую влажность воздуха, используют специальные субстраты для улучшения укоренения растений.

Проблемы высадки пробирочных растений в грунт связаны не только с адаптацией к новым условиям выращивания, но также со сложностью и трудоемкостью самой процедуры, невозможностью ее механизации. В решении обеих этих проблем большие перспективы связывают с использованием сформированных in vitro запасающих органов растений: клубней, луковиц, клубнелуковиц (в русскоязычной литературе их называют микроклубнями, микролуковицами, микроклубнелуковицами), а также искусственных семян (инкапсулированных соматических эмбриоидов). Их проще не только высаживать в грунт без всякой адаптации, но и хранить, транспортировать.

В настоящее время разработаны и широко используются промышленные технологии микроклонального размножения большого числа видов ценных цветочных и декоративных культур, они нашли широкое применение в производстве высококачественных семян картофеля, посадочного материала древесных и кустарниковых культур (плодовых, декоративных, применяемых в городском озеленении, лесовосстановлении).

Методы микроклонального размножения растений имеют большое значение не только для промышленного производства посадочного материала, но и поддержания генетических коллекций исходного материала в виде культур пробирочных растений и путем криоконсервации тканей или клеточных культур отдельных генотипов.

С целью снижения затрат при поддержании коллекций пробирочных растений используют различные методы замедления их роста, что позволяет увеличить промежутки времени между пересадками. Для этого применяют:

- пониженную температуру культивирования;

- пониженное атмосферное давление или снижение концентрации кислорода в воздушной среде, при которой производят культивирование;

- добавление в питательную среду осмотиков или регуляторов роста, замедляющих рост растений;

- получение и хранение при пониженных температурах запасающих органов растений (микроклубней, микролуковиц, микроклубнелуковиц) или инкапсулированных соматических эмбриоидов.

Сохранение биологических объектов в замороженном состоянии при -196оС в жидком азоте позволяет сохранять генетические коллекции бесконечно долго, так как сверхнизкие температуры полностью останавливают биохимические процессы в клетках. Разработан ряд методических подходов, применение которых обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток при замораживании. Эффективность криоконсервации можно повысить путем прекультивирования подлежащих замораживанию объектов в специфических условиях, позволяющих уменьшить содержание воды в клетках: выращивания на питательных средах, содержащих 2-6% маннита или сорбита, при пониженных температурах (4-6оС), высушивания в ламинарном потоке воздуха в сочетании с альгинатной инкапсуляцией. Большое значение для успеха криоконсервации имеет использование криопротекторов – веществ, защищающих клетки от повреждений при замораживании: глицерина, пропиленгликоля, этиленгликоля, диметилсульфоксида, аминокислот пролина или аспарагина, трегалозы, фиколла, альбумина, поливинилпирролидона, повышенных концентраций сахарозы.

Обычно применяют медленное замораживание (0,5-1оС в минуту) до -35оС в специальных аппаратах заводского производства, затем материал погружают в жидкий азот. Размораживание материала по завершении хранения, в отличие от замораживания, осуществляют быстро, помещая на 1-2 мин. извлеченные из жидкого азота пробирки на водяную баню, нагретую до +37-40оС. После этого культуры отмывают от криопротекторов (многие из них токсичны) и помещают на питательную среду для возобновления роста.

 

Дополнительная литература

 

Ермишин А.П. О производстве микроклубней безвирусных клонов картофеля// Селекция и семеноводство. 1994. N 4. С. 47-49.

Калинин Ф.А., Кушнир Г.А., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев.: Наукова думка. 1992.- 232 с.

Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М.: Наука, 1983. - 96 с.

Bhojwani S.S., Razdan M.K. Plant tissue culture: theory and practice. Elsevier. 1996.- 767 p.

 

Контрольные вопросы

 

  1. Какие преимущества по сравнению с традиционным вегетативным размножением имеет клональное размножение растений in vitro?
  2. Какие свойства апикальных меристем стебля делают их наиболее подходящим эксплантатом для получения культуры пробирочных растений с целью микроклонального размножения?
  3. Какие методические подходы позволяют повысить эффективность использования культуры меристем для получения свободных от вирусов пробирочных растений?
  4. Перечислите вещества с антивирусной активностью, применяемые в хемотерапии?
  5. Какие методы используют для клонального размножения растений in vitro?
  6. Опишите методику получения искусственных семян с помощью альгината. Для каких целей используют искусственные семена?
  7. В чем причины плохой приживаемости пробирочных растений при высадке их в грунт?
  8. Какие приемы позволяют улучшить адаптацию пробирочных растений к условиям ex vitro?
  9. Приведите примеры эффективного использования технологий микроклонального размножения растений в практической деятельности.
  10. Какие приемы используют для замедления роста пробирочных растений при поддержании генетических коллекций?
  11. Каким образом сохраняют жизнеспособность биологических объектов при их замораживании в жидком азоте?
  12. Назовите криопротекторы, которые используют для сохранения биологического материала растений в жидком азоте.

 




Дата добавления: 2015-01-30; просмотров: 131 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав




lektsii.net - Лекции.Нет - 2014-2024 год. (0.011 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав