Читайте также:
|
Культура клеток это клетки многоклеточного организма живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro).
Типы культур клеток.
| Тип клеток Свойства | Частично Трипсинизированные | Перевиваемые | Диплоидные |
| Происхождение | Из органов | Из первичных | Из первичных |
| Продолжительность жизни | 3-5 пассажей | Неограниченное количество пассажей | Около 50 пассажей: - гибель - перевивание |
| Кариотип | 2n | Xn | 2n |
| Способность образовывать опухоли | - | + | - |
Этапы получения первичной культуры.
1. Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).
2. Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.
3. Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина.
4. Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.
5. Проводят дробную трипсинизацию.
6. Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.
7. Центрифугация в течении 10 минут – 1000 об/мин, затем трипсин сливают.
8. Клетки помещают в питательную среду:
- среда 199
- среда Игла
- среда гидролизатлактальбумина.
9. Проводят подсчет клеток в камере Горяева
10. Клетки разводят питательной средой до посевной концентрации от 500 000 до 1 000 000 клеток на мл.
11. Добавляют 10% сыворотки КРС.
12. Разливают в пробирки, матрасы или роллерные колбы и культивируют.
13. После формирования монослоя (3-5 день) молодую культуру клеток заражают вирусом.
Лучше всего работать с диплоидными культурами клеток, так как как они свободны от контаменантов (бактерии, грибы, микоплазмы)
Перевиваемая культура клеток: получение, поддержание, свойства. Преимущества перед первичной культурой клеток. Методика биопробы на перевиваемой культуре клеток
Признаки репродукции вирусов в живых системах: лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток
Индикация вирусов в культуре клеток: заражение, видимые изменения и методы их контроля
Индикация вирусов в куриных эмбрионах: заражение, признаки репродукции вируса. Основной метод индикации гемаглютинирующих вирусов.
Куриный эмбрион (КЭ) - куриный зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития.
В микробиологической практике КЭ используют для выделения, культивирования и идентификации вирусов, риккетсий и иногда бактерий.
Использование куриного эмбриона имеет свои особенности: это доступная и управляемая система, благодаря чему можно получать результаты практически с помощью всех известных методов; работа с куриным эмбрионом, может быть реализована на любом этапе онтогенеза. Эмбрион является экологически чистым максимально изолированным от внешней среды объектом, что снижает вероятность спонтанного влияния внешних факторов в процессе эксперимента.
Для лабораторных целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой
Для заражения отбирают 4- 13-дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой.
Материал вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже материал вводят в тело эмбриона или в/в.
Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, к-рые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.).
Разработано несколько методов заражения куриных эмбрионов, но в практике чаще используют следующие методы:
на ХАО- например, вирусы оспы птиц и др.;
в аллантоисную полость- вирусы гриппа, ПГ-3 крупного рогатого скота, вирус болезни Ньюкасла и др.;
в амниотическую полость- вирусы риппа;
в желточный мешок- вирус ринопневмании лошадей.
Обнаружить вирус по следующим признакам:
по гибели зародыша в определенные характерные для соответствующего вируса сроки инкубации;
по патологоанатомическим изменениям в структурах куриного эмбриона, например, белые узелки (оспины) при оспе птиц, инфекционном ларинготрахеите кур и друих инфекциях или желто-зеленый цвет аллантоисной жидкости при гепатите утят и т.п.;
по реакции гемагглютинации (для обнаружения гемагглютинирующих вирусов, например, вируса болезни Ньюкасла, гриппа, ПГ-З и др.) При наличии вируса в эмбриональной жидкости куриного эмбриона через 3-7 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвести эритроцитов соответствующего вида животного образуются хлопья эритроцитов (агглютинация)
Индикация активного вируса: методы, живые системы, признаки положительной биопробы, примеры
Дата добавления: 2014-12-15; просмотров: 103 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |