Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Характеристика хроматографических методов анализа.

По характеру разделения хроматографические методы делятся на 4 группы:

адсорбционная хроматография – за счет адсорбционного равновесия между неподвижной твердой и подвижной жидкой фазами;

распределительная хроматография и ее разновидности: на бумаге – за счет равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной жидкой фазами; в тонком слое; газожидкостная – за счет равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной газовой фазами; ионообменная – за счет равновесия между ионообменной смолой и электролитом (подвижная фаза);

проникающая хроматография – за счет равновесия между жидкой фазой на внутренней и внешней поверхностях пористой структуры или «молекулярного сита»;

аффинная хроматография – за счет равновесного связывания макромолекулы с молекулой малой, по отношению к которой она проявляет высокую специфичность.

Адсорбционная хроматография. Разделение основано на различной адсорбируемости компонентов анализируемой смеси на адсорбенте. Эти свойства в основном определяются молекулярной структурой соединений. Вещество с более высоким коэффициентом распределения передвигается по поверхности адсорбента с большей скоростью. Если соединения окрашены, то при их разделении можно видеть окрашенные полосы. (рис 1.)

Рис. 1. Этапы хроматографического разделения на колонке:

а – поступление смеси стартовую точку;

б – опережение одного компонента другим;

в – появление на выходе;

Разделяемую пробу можно собрать в виде фракций пропусканием соответствующего растворителя через колонку, а затем производить анализ. Эффективность разделения во многом зависит от правильного выбора адсорбента.

Адсорбенты, применяемые в колоночной хроматографии, перечислены ниже.

Таблица 1.

Распределительная хроматография осуществляется на колонках (газожидкостная и колоночная хроматография) либо на специальной хроматографической бумаге (распределительная хроматография на бумаге).

Хроматографическаябумага обладает свойством задерживать воду между волокнами. Эту воду можно рассматривать как один из растворителей (неподвижная фаза). Если бумагу поместить в слой неводного растворителя, то под воздействием капиллярных сил неводный растворитель (подвижная фаза) будет перемещаться и молекулы анализируемого вещества, предварительно нанесенного на хроматографическую бумагу, будут распределяться между фазами в соответствии с их коэффициентом R_f.

В идеальном случае R_f определяется только природой вещества, параметрами бумаги и свойствами растворителей и не зависит от концентрации вещества и присутствия других компонентов.

По технике выполнения различают следующие виды хроматографии на бумаге: одномерную, двухмерную и круговую.

Первые два вида могут быть получены в восходящем и нисходящем потоке растворителей (рис 2). Однако двумерная хроматография открывает более широкие возможности в разделении сложных смесей, чем одномерная.

К хроматографической бумаге и растворителям предъявляются определенные требования: бумага должна быть однородной по плотности, химически чистой и инертной по отношению к разделяемым компонентам и подвижному растворителю.

Рис.2. Восходящая (а) и нисходящая (б) хроматография на бумаге:

1 – крышка; 2 – держатель; 3 – зажим; 4 – бумага; 5 – стеклянная камера; 6 – место нанесения пробы; 7 – растворитель; 8 – стеклянная палочка; 9 – лоток с растворителем.

При использовании тонкослойной хроматографии (ТСХ) сорбент распределяют тонким слоем (0,25 – 5,00мм) на стеклянные или металлические пластинки. Пробу в виде пятна наносят при помощи микропипетки на расстоянии примерно 2,5 см от нижнего края пластинки. Разделение проводят в стеклянной камере, на дно которой налит растворитель слоем 2см. Пластинку оставляют в камере на определенное время для уравновешивания в закрытом состоянии.

Многие специальные сорбенты для тонкослойной хроматографии содержат флуоресцирующие красители, поэтому после разделения можно просматривать пластины в ультрафиолетовом свете и при этом отдельные компоненты разделяемой смеси выявляются на них в виде окрашенных пятен.

Рис.3. Двухмерная хроматограмма.

Эффективность разделения можно повысить с помощью двухмерной хроматографии (рис.3).

Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) основан на распределении анализируемых соединений между жидкой и газовыми фазами. Благодаря высокой чувствительности и быстроте разделения он используется для количественного и качественного анализов.

Основное преимущество данного вида хроматографии перед другими методами заключается в том, что благодаря большой скорости десорбции разделяемых компонентов в газовой среде можно значительно ускорить продвижение проявителя (газа-носителя) и тем самым ускорить процесс разделения. Так, анализ пятикомпонентной смеси летучих углеводов, спиртов, жирных кислот, эфиров и т.д. на газовом хроматографе с высокочувствительным детектором может быть проведен за 5 мин.

По полученным хроматографическим кривым можно определить количественный состав анализируемой смеси путем измерения высоты максимумов пиков, а также найти произведение удерживаемого объема разделяемых веществ на высоту пиков. Площадь пиков в данном случае находят с помощью планиметра, взвешиванием на аналитических весах вырезанного из бумаги пика и сравнением с массой куска той же бумаги известной площади, либо умножением половины высоты пика на его ширину. Удерживаемый объем рассчитывают по оси объемов от момента ввода порции анализируемой пробы до момента достижения максимума пика.

В стандартных условиях (температура, скорость пропускания газа-носителя и т.д.) время прохождения анализируемого соединения через колонку является постоянной величиной и называется временем удерживания. При количественном анализе в ГЖК используют внутренний стандарт – соединение, которое по физическим свойствам очень близко к исследуемому, и при хроматографировании движется вдоль колонки.

Отечественная промышленность выпускает хроматографы лабораторного и промышленного типов, обладающие чувствительностью, для некоторых типов

5 × 10^-14 моль/с.

В основе ионообменной хроматографии многих соединений (аминокислот, органических кислот, сахаров и т.д.) лежит способность к ионизации, обусловливающая суммарный положительный или отрицательный заряд.

Рис. 4. Принципиальная схема газожидкостного хроматографа (а) и

пламенно-ионизационного детектора (б):

/ — детектор; 2 — усилитель; 3 — самописец; 4 — интегратор; 5 —место введения пробы;

S — устройство, регулирующее температуру термостата; 7 — хроматографическая колонка;

8 — термостат; 9 — запальное устройство; 10 — выходное отверстие; 11 — пламя; 12 —

Электрод

Разделение веществ с помощью этого вида хроматографии проводят на колонках, заполненных ионообменной (катионо или анионообменной) смолой. Набухшую смолу помешают в колонку (рис 4) и подвергают регенерации, пропуская через нее раствор НСl молярной концентрацией 1 моль/дм³ (для катионообменной) или NaOH той же концентрации (для анионообменной). Затем колонку промывают дистиллированной водой до полного удаления регенерирующего вещества, после чего она готова к хроматографированию. Этот принцип используется во всех промышленных приборах – автоматических аминокислотных анализаторах.

Для разделения ионообменной хроматографией высокомолекулярных соединений (белков, нуклеотидов и др.) в качестве фильтра широко применяется модифицированная целлюлоза.

Метод проникающей хроматографии заключатся в разделении молекул по размерам при пропускании через плотное молекулярное сито. Разделение веществ при помощи гелей, основанное на том же принципе, называется гель-фильтрацией.

В качестве молекулярного сита при проникающей хроматографии используют гели с поперечными сшивками (сефадексы), агарозные гели (сефароза, биогель-А), полиакриламидный гель (биогель-Р) и полистиролы (биобидз-S), а также пористые стеклянные шарики (биоглас) и пористый кварц (поросил). Изменяя число поперечных сшивок, удается получать несколько типов сефадексов, различающихся степенью пористости частиц, что позволяет успешно применять их для разделения веществ с различными размерами молекул.

При проникающей хроматографии также пользуются колонками. В последнее время для разделения аминокислот, углеводов, стероидов и липофильных соединений применяют тонкослойную гель-фильтрацию на пластинках.

В основе метода аффинной хроматографии лежит уникальное свойство макромолекул – биологическая специфичность, что позволяет при разделении получать вещества высокой степени чистоты. Поэтому аффинная хроматография успешно применяется для очистки белков, витаминов, ферментов и других высокомолекулярных соединений.

Для разделения веществ методом аффинной хроматографии необходимо точно знать кинетические свойства исследуемых соединений, например ферментов.

При очистке всех видов макромолекул методом аффинной хроматографии наблюдается следующее:

М+Л (4)

Его эффективность (а следовательно, и очистка) зависит от природы образующегося комплекса МЛ (Л – лиганд для матрицы).

Чтобы правильно выбрать лиганд для этого процесса, необходимо знать свойства подлежащих очистке макромолекул. Лиганд должен содержать химическую группу, которая не участвует в связывании лиганда с макромолекулой, но посредством которой идет его сшивание с матрицей. Чтобы в процессе сшивания не нарушалась способность к связыванию, целесообразно использовать специальные удлиняющие «мостики» (чаще всего это диамины типа NH₂(CH₂)_x - NH₂, где Х= 2 ÷6).

Колонка для аффинной хроматографии заполняется связанной с лигандом матрицей и уравновешивается буферным раствором, который используется для растворения исследуемого вещества.

Идеальная нерастворимая матрица для аффинной хроматографии должно содержать большое число химических групп, способных ковалентно связываться и с лигандом, не разрушаться при связывании и последующей элюации макромолекул, обеспечивать быстрое протекание растворителя. Обычно в качестве матрицы применяют агарозу, синтетические полиакриламидные гели, полистирольные смолы и пористые стеклянные шарики.

Методики, основанные на использовании хроматографических методов разделения, довольно разнообразны и позволяют успешно исследовать практически любые пищевые продукты.

Благодаря высокому уровню развития экспериментальной техники и инструментального оснащения современные хроматографические методы позволяют с большой степенью точности и воспроизводимости решать сложные аналитические задачи, стоящие перед работниками лабораторий контроля качества пищевых продуктов, полуфабрикатов и сырья. В последние годы вследствие усовершенствования хроматографического метода были достигнуты высокая эффективность, значительная скорость разделения, что позволяет его использовать и как микроаналитический метод.

Контрольные вопросы

1. Какие процессы лежат в основе хроматографического анализа?

2. Опишите процесс хроматографического разделения. Как рассчитываются коэффициенты К и R_f?

3. Перечислите основные критерии целесообразности использования той или иной хроматографической системы.

4. На какие группы по характеру разделения делятся хроматографические методы?

5. Каков принцип адсорбционной хроматографии?

6. Каков принцип распределительной хроматографии?

7. Каков принцип тонкослойной хроматографии?

8. Каков принцип газожидкостной хроматографии.

9. Каков принцип ионообменной хроматорграфии?

10. Что лежит в основе аффинной и проникающей хроматографии?

Рекомендуемая литература

1. Айвазов Б.В. Основы газовой хроматографии. – М.: Высшая школа, 1987-182с.

2. Лобанов Ф.И. и др. Методы анализа пищевых продуктов. М.: Из – во «Наука», 1988 – 192с

3. Снегирова И.А. Жванко Ю.Н. Современные методы исследования качества пищевых продуктов. М.: Экономика, 1989– 219с

4. Марх А.Т., Зыкина Т.Ф. Технохимический контроль консервного производства. – М.: Агропромиздат, 1989 – 304с

5. Руководство по методам анализа качества безопасности пищевых продуктов / под. ред. И. М. Скурихина, Тутельян В.А. Медицина, 1998

6. Парамонова Т.Н. Экспресс – методы оценки качества продовольственных товаров. – М.: Экономика, 1988 – 110с