Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

ВАКЦИНИ ТРЕТЬОГО ПОКОЛІННЯ

ПЛАН

1. Штучні вакцини

2. Генно-інженерні вакцини

З початку варіоляції в Англії (1796 р.) і до кінця ХІХ століття були запропоновані та з різним успіхом апробірувані 4 препарати (вісповакцина, пастерівська антирабічна вакцина, протихолерна вакцина Хавкіна, тифозна вакцина Райта), за наступні 60 років було створено вже 14 профілактичних препаратів, у тому числі вакцина БЦЖ, вакцини проти поліомієліту, жовтої лихоманки, кліщового енцефаліту та ін. З 1970 по 1975 р. було вдосконалено та створено ще 8 вакцин (полісахаридні менінгококові вакцини, культуральні вакцини проти сказу, кліщового енцефаліту та ін.). За період з 1976 по 1990 р. число засобів специфічної імунної профілактики збільшилось більш ніж на 25 найменувань. Частина препаратів уже увійшла в широку практику, інші знаходяться на різних стадіях досліджень.

Отримання генно-інженерними методами імунологічно активних білків з певними антигенними властивостями являє собою дослідну задачу великої складності і суттєвого практичного значення, оскільки до такого класу імуногенних білків відносяться практично усі вірусні і певна частина мікробних вакцин. Нагадаємо відомі факти, що імуногенність або властивість викликати в організмі утворення антитіл залежить від наявності на поверхні білкової молекули так званих епітопів або антигенних детермінант, утворених шести-восьми амінокислотними залишками, які найбільш схожі до активного центру антитіла. (Епітони – антигенні детермінанти – утворені 6-8 залишками АК, які схожі (з’єднання) з активним центром антитіла)

Поміж нових засобів боротьби з масовими інфекціями (наприклад, менінгіти різної етіології, вірусні гепатити), створені або знаходяться в стадії розробки вакцини для профілактики захворювань, які викликаються умовно-патогенними мікроорганізмами. Активно створюються засоби імунопрофілактики венеричних захворювань, включаючи СНІД. Поставлено питання про застосування вакцин для профілактики деяких онкологічних захворювань, насамперед раку шийки матки та печінки (у першому випадку етіологічний агент – вірус простого герпесу типу 2, другому – вірус гепатиту В).

Згідно прогнозів, вакцини третього покоління, як інактивовані, так і живі, у ХХІ століть будуть існувати у вигляді полівалентних конструкцій, які містять багато протективних антигенних детермінант різних мікроорганізмів, що дозволить за допомогою 1-2 ін’єкцій створювати захист від основних збудників хвороб людини.

У зв’язку з вирішенням проблем боротьби з іще не переможеними інфекціями людини та тварин, так і з підвищенням вимог до безпечності та чистоти препаратів розвиток робіт по створенню штучних вакцин нового покоління тісно пов’язаний з досягненнями препаративної біохімії, генної інженерії, хімічного синтезу полімерних детермінант, хімії фізіологічно активних високомолекулярних сполук.

Ідея створення синтетичних вакцин (сполук), запропонована M. Sela. Цей процес включає синтез набору виняткових специфічних антигенних детермінант, схожих на природні і наступне конструювання з них макромолекул, які одночасно несуть декілька таких фрагментів. Інший напрямок, розвинуте Р.В. Петровим та співавторами, складається з приєднання антигенів або отриманих синтетичних сполук до високомолекулярних синтетичних поліелектролітних імуностимуляторів, які забезпечують підвищений рівень специфічної імунної відповіді, її Т-незалежність і відсутність Ir-генного контролю її сили.

2. Загальні положення. Штучна вакцина представляє собою макромолекулярний комплекс, який складається з антигену та носія - імуностимулятора. Особливість антигенів більшості збудників інфекцій полягає в тому, що вони відносяться до категорії слабких антигенів, тобто на них не розвивається виражена імунна відповідь. Вочевидь, що потрібні нові принципи створення вакцин, які передбачають необхідність знаходження способів стимуляції імунної відповіді на слабкі антигени. Відомо, що вакцини, отримані традиційними методами, викликають ряд небажаних побічних ефектів, пов’язаних з їх реактогенністю та токсичністю. Для утворення імунітету необхідно 1-2 антигенні детермінанти, а в організм вводиться ряд складних комплексів.

Сучасна тенденція розвитку вакцинопрофілактики характеризується отриманням вакцинних препаратів з хімічно визначеним антигенним складом та регульованою імуногенністю. У зв’язку з цим проблема створення вакцин нового покоління тісно пов’язана з необхідністю отримання високо очищених активних антигенів.

Необхідно отримати таку штучну, хімічно визначену біоорганічну систему, яка б забезпечила імунну відповідь організму на даний антиген всупереч його генетично визначеній низькій відповіді.

Останнім часом встановлено, що на один і той же антиген індивідууми одного генотипу реагують розвитком високої імунної відповіді, тоді як у індивідуумів іншого генотипу розвивається слабка реакція, або вони не реагують зовсім. Пояснення вказаного феномену було знайдено з відкриттям генів імунної відповіді – Ir- і Is-генів. Стало зрозуміло, що якщо індивідуум або велика частина популяції містить Ir-ген низької відповіді або Is-ген сильної супресії до головних антигенів якого-небудь інфекційного агенту, то викликати у такого індивідуума або популяції ефективну імунну відповідь традиційним способом вакцинації неможливо.

Оскільки основним місцем експресії Ir-генів являються Т-лімфоцити, одним із шляхів „обходу” може бути забезпечення Т-незалежності імунної відповіді на даний антиген. На даний час відкритий і всесторонньо вивчений новий клас імунопотенціаторів – синтетичних поліелектролітів.

Стимуляція імунної реакції при введенні синтетичних поліелектролітів складається із стимулюючої дії поліелектроліту на деякі етапи імуногенезу і, що особливо важливо, на метаболізм, диференціювання та поділ окремих імунокомпетентних клітин. Мішенями імуностимулюючої дії синтетичних полііонів можуть бути стовбурні клітини, незрілі тімоцити, В-лімфоцити, Т-хелпери, макрофаги-хелпери.

Механізм дії поліелектролітів тісно пов’язаний з їх здатністю до кооперативної сорбції на поверхні імунокомпетентних клітин. Мембраноактивність поліелектроліту виражається в його мітогенності. Під впливом полііону відбувається утворення мікро агрегатів інтегральних білків у зовнішній мембрані клітини, що приводить до зміни її проникності для іонів і до запуску імунної відповіді. Досить важливий кінцевий результат цього процесу – клітина видаляє з мембрани кластеризовані білки (з визначеним маркером) і таким чином відновлює порушену проникність мембрани для іонів і води.

Використання полііонів як факторів, які забезпечують тимуснезалежність, відкриває широкі перспективи як для фенотипової корекції генного контролю імунної відповіді, так і для стимуляції Т-дефіцитної відповіді при одержаних та вроджених імунодефіцитних станах, при яких дефекти імунної системи локалізуються на рівні системи Т-клітин.

Вимоги: використання полімерних носіїв, які мають власну специфічну активність представляє великий практичний інтерес, ніж застосування інертних в біологічному відношенні сполук. При цьому важливо, щоб полімерний імуностимулятор не мав алергічних властивостей. Згідно вимог фармакології, полімерний носій та продукти його метаболізму повинні бути нетоксичними, не канцерогенними, апірогенними, не викликати інші побічні ефекти. Крім того, полімер повинен виводитись з організму після виконання своєї корисної функції. З фізико-хімічних вимог слід відмітити необхідність досить реакційно-здатних функціональних груп у макромолекулі, за допомогою яких можна ковалентно приєднати антигени в м’яких умовах. Завжди використовують карбоксильні, гідроксильні, альдегідні та аміногрупи. Полімерний носій повинен розчинятися у воді і фізіологічних розчинах, бути стійким при зберіганні і містить групи гідролізу в основному ланцюзі макромолекули.

В експериментальних дослідах широко використовують природні носії – повний ад’ювант Фрейда (ПАФ), неповний ад’ювант Фрейда (НАФ), ліпополісахарид та ін. і синтетичні ад’юванти – мурамілдіпептид (МДП), гідроокис алюмінію та ін. В якості поліелектролітних носіїв фізіологічно активних сполук найбільш часто застосовують функціональні полімери карболанцюгової природи. Широко використовують поліакрилову і поліметакрилову кислоти, сополімери N-вінілпиролідону з акриловою, кротоновою кислотами, акролеїном, вініламіном, малеіновим ангідридом та іншими вініловими мономерами.

В експериментальних дослідженнях в якості полімерних носіїв антигенів широко застосовуються різні білки – токсини. Але білкові і поліпептидні імуностимулятори малодоступні і дорогі.

Більшість досліджень присвячено застосуванню в якості полімерних носіїв максимально інертних в біологічному відношенні сполук природного або синтетичного походження. А саме – декстрану, целюлози, агарози і синтетичних полімерів – поліетиленгліколю, похідних полівінілпіролідину, полівінілового спирту, поліакриламідів. Значного підвищення імуногенності антигенів за допомогою цих носіїв не було досягнуто. Подальші перспективи дослідження інертних носіїв антигенів пов’язані з їх перетворенням в імуностимулятори шляхом ковалентної кон’югації з імуномодуляторами.

Багатообіцяючими бачаться перспективи практичного використання похідних гетероланцюгових полімерів. Наявність в гетероланцюгових полімерах функціональних груп в основному ланцюзі макромолекули відкриває практично безмежні можливості для перетворень і утворення нових сополімерів з широким спектром фізико-хімічних і біологічних властивостей.

Можна виділить два основних напрямки отримання антигенів, які не містять сторонніх антигенних субстанцій: 1) пов’язане з виділенням високо очищених антигенів з природного матеріалу методами препаративної біохімії або генної інженерії; 2) пов’язане з хімічним синтезом антигенних детермінант або фрагментів антигенів. В якості проективних антигенів розглядають сполуки або їх фрагменти, які безпосередньо приймають участь у взаємодії збудника з клітиною (адгезини), у проникненні і розповсюдженні в організмі (різні ферменти), у блокуванні процесу фагоцитозу (протеїни оболонки), а також токсини.

Інший, альтернативний підхід до вибору антигену при конструюванні синтетичних вакцин полягає у використанні загальновідомих антигенів.

Вибір антигенної детермінанти – досить складна задача. Розшифровка первинної структури антигенів ряду вірусів на основі отримання нуклеотидної послідовності вірусної ДНК, створення комп’ютерних методів знаходження детермінантних епітопів дозволили розробити ряд рекомендацій для селекції пептидів, які можуть бути використані як імуногени.

Вимоги: 1) пептид повинен містити контрольоване число полярних або заряджених амінокислот, які забезпечують розчинність у водних розчинах; 2) кількість амінокислот в пептиді повинно перевищувати пентаметри; 3) пептиди, які містять пролінові залишки додатково до полярних або заряджених амінокислотних залишків, як правило, призводять до утворення антитіл, які реагують з конформаційно нативним білком; 4) синтетичні пептиди повинні також містити залишок, через який їх приєднують до носія.

Виділення високомолекулярних антигенів можливо традиційними методами препаративної біохімії або методами генної інженерії. На даному етапі більш перспективно застосування для цієї цілі методів препаративної біохімії, особливо у випадку необхідності забезпечення досить високих виходів потрібного антигену (поверхневі та внутрішні білки вірусу грипу – гемаглютинін, нейрамінідаза, М₁, М₂, NP; полісахариди сальмонел та ін.). Обидва методи передбачають очистку з суміші. Разом з тим генно-інженерний спосіб дозволяє отримувати тільки антигени білкової природи, причому утворення третинної структури, звичайної для високо очищених білків, ізольованих з інтактних вірусів, для тих же білків, отриманих шляхом мікробіологічного синтезу, нехарактерно.

При отриманні кон’югатів антигенів з іоногенними поліелектролітами утворюється, поміж ковалентних зв’язків, велика кількість електростатичних і комплексних зв’язків. Очевидно, що вклад цих зв’язків у формуванні структури кон’югату буде залежати від хімічної структури полімерного носія і антигену, що може вплинути на його імуногенність.

Серед багатьох методів ковалентного зв’язування найбільш широко розповсюджені карбодіємідний, бромціановий, хлортриазиновий, а також за допомогою глутарового альдегіду. Ці методи, однак, навряд чи можуть задовольнити технологів та фармакологів з точки зору вимог отримання стабільних і нетоксичних препаратів.

Дані експериментальних робіт дозволяють на основі порівняння штучних антигенів, отриманих різними методами, зробити висновок, що утворення ковалентних міжмолекулярних зв’язків значно підвищує ефект стимуляції, а шляхом електростатичного і комплексного зв’язування, не вдається досягнути бажаного ефекту.

Аналіз даних літератури свідчить, що хімічна природа й імуностимулюючі властивості носія, характер, розмір та положення ковалентного зв’язку, а також хімічна структура антигену, носія, склад і структура кон’югату суттєво впливає на імуногенність синтетичної вакцини.

У процесі розробки і виробництва напівсинтетичних вакцин проблеми виникають у поєднанні хімічного і мікробіологічного виробництва.

На даному етапі розробки штучних вакцин на основі синтетичних пептидних фрагментів можна констатувати, що задача підсилення утворення антитіл вирішується успішно, однак високої імуногенності ще не досягнуто. Тому підвищення ефективності і специфічності синтезуючих вакцинуючих макромолекулярних систем залишається головним завданням дослідників, які працюють над створенням штучних вакцин.

Підходи до вирішення завдання підвищення імуностимулюючої активності полімерного носія та імуногенності кон’югату пов’язуються останнім часом із створенням макромолекулярних систем, які діють на різні сторони імунного процесу. Ефективність синтетичних і природних носіїв, кон’югатів на їх основі може бути значно змінена шляхом їх модифікації різними імуностимулюючими агентами.

Модифікація антигенів і антигенних детермінант різними високомолекулярними носіями-імуностимуляторами і ад’ювантами являється загальним принципом створення штучних імуногенів і вакцин, які забезпечують підвищений рівень специфічної імунної відповіді.

На відміну від збудників, продуценти не можуть синтезувати макромолекули, які відповідають за патогенетичний ефект, тобто які викликають основний симптомокомплекс захворювань. Це досягається за рахунок виявлення та подальшого клонування у складі векторних молекул особливо тих генів, які відповідають за синтез протективних антигенів.

2. Генно-інженерні вакцини

Спроби отримання противірусних вакцин з допомогою генно-інженерного підходу до недавнього часу будувались на виділенні із вірусного геному того гену, котрий кодує поверхневий білок вірусної частини. Цей білок містить декілька антигенних детермінант, проти яких в організмі перехворівши або вакцинованих людей виробляються протективні (вірусонейтралізуючі) антитіла. На основі таких генів у складі рекомбінантної ДНК в клітинах бактерій або одноклітинних еукаріот здійснювали синтез вірусного білка, який після відповідної концентрації та очищення повинен був би стати дешевою та безпечною противірусною вакциною субодиничного типу.

Саме таким чином була здійснена експресія в бактеріях або дріжджах генів, які кодують поверхневий білок гемаглютинін вірусу грипу або VP-1- або VP-3-поліпептид вірусу ящуру, HBS - антиген вірусу гепатиту В людини, та ряду інших вірусів. Однак ні один із цих білків, успішно синтезованих в мікроорганізмах, не став та й навряд чи стане в майбутньому противірусною вакциною.

Головна причина такого прогнозу заключається в особливостях структури, функції та шляхів формування капсидних вірусних білків. Всі вони являють собою складні білки, побудовані із декількох поліпептидних ланцюгів, формування котрих в клітині, як правило відбувається за участю додаткових білкових факторів, процесу чи модифікації в умовах взаємодії з клітиною або вірусною мембраною і ліпідами. Оскільки в бактеріальній або дріжджовій клітині таких умов немає, то вірусний білок, отриманий шляхом мікробіологічного синтезу представлений мономерними полі – пептидами, котрі не можуть збиратися в правильну четвертинну структуру, і відповідно не імуногенними, так як антигенні детермінанти, відповідальні за синтез вірусонейтралізуючих антитіл, або не експоновані, або серед них відсутні конформаційні епітопи. Наприклад, значною перепоною на шляху створення біотехнологічної схеми синтезу HBS – антигену є відсутність виділення його в середовище і необхідність попереднього руйнування дріжджових клітин, що в виробничих умовах пов’язане із значними труднощами. Ця обставина, а також відсутність глікозування HBS – антигену в дріжджових клітинах вимагає подальших досліджень, перед тим, як ці об’єкти можна буде використовувати для синтезу вірусної вакцини або діагностики проти гепатиту В.

Однак, якщо говорити про більш віддалене майбутнє, то мікробіологічний синтез противірусних вакцин уявляється значно більш перспективним по відношенню до еукаріотичних систем синтезу. Але це будуть уже не ті генно-інженерні вакцини першого покоління, конструкції яких розробляються сьогодні і основані на використанні повномірних капсидних білків. Доводиться признавати, що при вирішенні завдань генна інженерія сьогодні лише сліпо копіює природу, намагаючись добитись своєї мети, точно повторюючи з генно-інженерних методів повномірний капсидний білок вірусу. Але природа створювала такі високомолекулярні білки у процесі тривалої еволюції для формування оболонки вірусних частин, для транспорту і захисту вірусних геномів, для специфічного упізнавання вірусами певних клітинних рецепторів і для забезпечення ранніх стадій взаємодії вірусу з клітиною. В наміри еволюції менше всього входило зробити капсидні білки вірусів зручним засобом для вироблення протективних антитіл в організмі, де відбувається реплікація вірусу.

Генно-інженерні вакцини другого покоління будуть, швидше за все, будуватись на синтезі не повноцінного вірусного білка, а невеликих ділянок вірусного поліпептиду, які несуть головні антигенні детермінанти. Досліди з вірусом ящура, грипу, гепатиту В та аденовірусів свідчать про те, що хімічно синтезовані або отримані шляхом протеолізу короткі олігопептиди, які відповідають антигенним детермінантам, самі по собі володіють імуногенною активністю, яка при певних обставинах може наближуватись до імуногенного інтактивного вірусу.

Більш перспективний і технологічний генно-інженерний шлях синтезу антигенних детермінант на матриці рекомбінантної ДНК в складі химерного білка, оскільки короткі олігопептиди швидко руйнуються в бактеріальній клітині. Антигенна детермінанта, або детермінанти різних серотипів або видів вірусу повинні бути встроєні в молекулу білка-носія, навмисне сконструйованого таким чином, щоб забезпечити експонування епітопних ділянок білкової молекули в мономерній формі. В цьому випадку полі антигенні генно-інженерні вакцини другого покоління виявляться технологічними і з точки зору можливостей мікробіологічного синтезу.

Тут ще багато незрозумілого, ми поки що знаходимося на самому початку шляху, але описані досліди відкривають принципово нову перспективу конструювання генно-інженерних вакцин третього покоління з неприродними антигенними детермінантами і дуже широкого спектру дії, можливо, навіть на рівні роду. Важливо відмітити, що окрема, хоча і дуже важлива народногосподарська задача конструювання і виробництва генно-інженерних вакцин майбутнього повинна бути частиною фундаментальної проблеми, направленої на створення методами генної інженерії штучних білків з наперед заданими властивостями і структурою, які являють собою покращенні варіанти своїх природних аналогів.