Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Определение количества ТЛ и БЛ с использованием сывороток.

Норма БЛ 20-30%, норма ТЛ 70-80%, есть нулевые клетки 3-5%. При лейкозе и аутоиммунных заболеваниях, меняется соотношение за счет увеличения. От лейкоза не погибают, погибают от секундарки.

Имеющиеся в настоящее время методы позволяют определять у сельскохозяйственных животных только популяции ТЛ и БЛ. О субпопуляциях не говорим. Применявшиеся до недавнего времени широко метод розеткообразования основан на том, что все зрелые периферические ТЛ имеют на своей мембране адгезивную молекулу CD-2. Эритроциты баранов имеют другую адгезивную молекулу CD58, способную взаимодействовать с CD2, в результате чего эритроциты барана фиксируются на мембране ТЛ, в результате чего образуются розетки. Они считаются. Покрывают неполностью. Результатом метода в виду его нестандартности и трудоемкости следует считать получение не вполне корректных результатов. Т.к. в отличие от человека, где образуются стойкие розетки, у животных эти розетки образуются и распадаются, они не являются стойкими и 1. не доходят до момента учета. Отсюда идет разброс результатов. 2. Этот метод в значительной степени связан с количественными показателями молекул CD2, экспрессированных на мембране эритроцита, так что, скорее всего, он является тестом на CD2 адгезивную способность ТЛ, а не на их количественную характеристику.

Преимуществом предлагаемого метода определения ТЛ и БЛ является получение стабильных результатов с меньшими затратами времени. Метод с антииммунными глобулиновыми сыворотками основан на наличии у БЛ рецепторов к Fc фрагменту иммуноглобулинов. В то время как ТЛ не имеют таких рецепторов. Определение количества ТЛ и БЛ и их соотношения у СХЖ целесообразно в следующих случаях:

v При диагностике иммунодефицитов

v При оценке клеточного звена иммунитета

v Для выявления лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваний.

v За контролем за ходом лечения

На долю БЛ приходится 20-30%, ТЛ 70-80%, кроме того есть от 3 до 5% лимфацитов, не имеющих ни ТЛ, ни БЛ рецепторов и характеризующихся, как нулевые клетки.

Подготовка к постановке реакции:

1. Антикоагулянт мягкий – цитрат

2. Приготовить забуференный физраствор, рН 7,2 /строго/. Готовят не на дистилляте, а на физрастворе.

3. Раствор антииммуноглобулиновых сывороток, лиофильно высушенных 1 шт. G и 1 шт. M. Можно пользоваться до полного истощения.

4. Чашки петри, маленькие, обработанные раствором антииммуноглобулиновых сывороток. 2/3 чашки раствора, затем оставить на полчаса.

5. Раствор сливаем, упаковываем в фольгу, целлофан, в морозилку /если хранить/.

6. Конические градуированные и неградуированные центрифужные пробирки. Предварительно обработанные силиконом, чтобы ничего не прилипло к стенкам. 4 пробирки, силикон не дает избежать потери подсчитываемых данных.

7. Градиент плотности 1,076-1,077. Допустим,

a. фикол-пак, или

b. гисто-пак, или сами готовим

c. фикол-верографин

8. их либо разводят, либо добавляют до необходимой плотности

9. гемолизирующий буфер, который готовят из хлористого аммония, нужен для забора эритроцитов, они не нужны, надо убрать эритроциты!

10. Центрифуга на 1-2 тыс. оборотов/мин

11. Микроском

12. Камера горяева

13. Пипетки. Пастеркой из груши – надо привыкнуть – надо после взятия сразу горизонтировать.

Ход реакции

1. Кровь берем цитратом из расчета 10 мл крови+1 мл цитрата /берем с запасом!!!!!!!/может не выдержать стекло, выдавить дно пробирки. Если крови мало, возводим в обратку! Если меряем 0,5, умножаем на 2.

2. В неградуированную центрифужную пробирку вносим 2,5 мл градиента плотности и наслаиваем (!!!!!!!!), по стенке, на него 1 мл стабилизированной крови

3. Центрифугируем 40 минут при 1 тыс об/мин. В результате видим внизу эритроциты, над ними лежит серебристая пленочка – гранулоциты, затем, прозрачное – раствор, градиент плотности. Затем, желтая плазма, затем кольцо лимфоцитов. Они образуют конгломераты – кратеры, возвышения, бугристая поверхность.

4. Очень аккуратно /потом неповторимо/ собираем кольцоэритроцитов (вводим в пробирку, проходя через плазмы), собираем лимфоциты, захватывая и плазму и градиент плотности, сливаем в пробирку, доводим до 10 мл забуференным физраствором, центрифугируем 10 минут. Для отмывания от плазмы и от градиента плотности. Лимфоциты на дно оседают, сливаем то, что навернху. Они не выпадут. Если нет кольца, все хорошо, если есть кольцо эритроцитов, добавляем половину пробирки около 5 мл /смотря сколько эритроцитов на дне/, гемолитического буфера, в центрифугу, отмываем. Больше нету.

5. Убираем надосадок, пипеткой, берем надосадок, сливаем, пока нет 1 мл. затем, осадок тщательно размешиваем, энергично пипетируем, чтобы не было комков, переносим в чашку петри. Равномерно распределяем по поверхности дна. Нельзя спешить! Мало, и надо,чтобы не было пузырей и чтобы все дно было покрыто

6. Оставляем чашку петри при комнатной температуре на 40 минут и на 30 минут в холодильник, перемешивая каждые 10 минут /крышкой, круговыми движениями/. При низкой температуре они очень хорошо фиксируются. БЛ можно отдирать зубной щеткой

7. 2 пробирки: ТЛ+0, БЛ. За час 10 минут произошло разледение. БЛ сели на дно, ТЛ плавают + нулевые клетки. Разделили. Сначала очень аккуратно наклонили чашку, собрали, внесли в пробирку, взяли буфер, залили и снова собрали. Затем, поставили под микроскоп, проверили на плавающие клетки, собрали пока плавают! Довели до 10 мл. затем отмывают БЛ, собираешь, отковыриваешь бэлимфоцитные грядки, отмываем под давлением буферным. Доводим до 10 мл, центрифугируем. 10 минут 1то/мин. Убираем надосадок, оставляя 1 мл. осадок тщательно суспендируем, чтобы не было взвеси, заправляем в камеру горяева и считаем, как обычные лейкоциты в пяти больших квадратах, по-диагонали, начиная с верхнего левого угла и вниз, и на боковых поверхностях, а у нижнего правого, то что находится на правой и нижней границах. Считаем, полученный результат умножаем на коэффициент=50, и получаем количество ТЛ и БЛ. Объем камеры горяева 0,02 мл. 0,02*50=1.

8. Заносим данные в таблицу