Студопедия  
Главная страница | Контакты | Случайная страница

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

ДНК-маркеры на основе ПЦР с праймерами, имеющими множественную локализацию в геноме

Читайте также:
  1. Адвокатская неприкосновенность
  2. Алюминий. Классификация сплавов на основе алюминия, маркировка
  3. Анализ данных на основе их сортировки.
  4. Анализ платежеспособности предприятия на основе ликвидного баланса
  5. Анализ финансовой устойчивости ПРУП «Борисовский хрустальный завод» на основе абсолютных показателей
  6. Анализ финансовой устойчивости ПРУП «Борисовский хрустальный завод» на основе относительных показателей
  7. АНАЛИЗАТОРЫ СПЕКТРОВ НА ОСНОВЕ RC МОСТОВ И ГЕТЕРОДИННЫЕ АНАЛИЗАТОРЫ.
  8. В основе большинства человеческих отношений лежат экономические интересы, которые, в свою очередь определяются отношением к собственности.
  9. В основе взглядов классиков лежит трудовая теория стоимости. Классики считали, что богатство общества является результатом труда всей нации.
  10. В основе данного уголовно-правового запрета лежат нормы международного права.

Особый класс ДНК-маркеров основан на использовании праймеров, имеющих множественную локализацию в геноме. Это может быть достигнуто при использовании одного короткого праймера с произвольной последовательностью (RAPD - Randomly amplified polymorphic DNA и ее аналогов), при использовании праймеров с искусственно добавленными последовательностями (адаптерами) (AFLP - Amplified fragment length polymorphism) или праймеров, комплементарных к повторяющимся элементам генома, таким как микросателлиты (ISSR - Inter-simple-sequence-repeats) или транспозоны (IRAP - Inter-retransposon amplified polymorphism).

RAPD-маркеры. К этой группе относятся маркеры, основанные на ПЦР с применением праймеров с произвольной, случайной последовательностью. Для синтеза таких праймеров нет необходимости в знании конкретных нуклеотидных последовательностей генома исследуемого организма. Праймеры с произвольной последовательностью должны лишь отвечать определённым требованиям по соотношению GC-пар (около 60%) и длине. Этот метод был предложен независимо двумя группами исследователей и получил название RAPD (Random Amplified Polymophic DNA) или AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR). Суть метода заключается в амплификации фрагментов ДНК с использованием единичного короткого праймера с низкой температурой отжига в реакции ПЦР. Праймер связывается с геномной ДНК в двух различных участках инвертированных повторов. При электрофоретическом разделении амплифицированных продуктов образуются дискретные продукты, размер которых варьирует от 100 до 5000 п.н. (ДНК-паттерны). Эти фрагменты представляют собой анонимную, как правило, уникальную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами. Различия в ДНК-паттернах определяются различиями в одном или обоих праймер-связывающих сайтах (наличие или отсутствие полосы ПЦР-продукта в спектре) или присутствием инсерции/делеции в амплифицируемом фрагменте (различия ПЦР-продуктов по размеру). Большинство RAPD-маркеров являются доминантными (наличие/отсутствие полосы в ДНК-паттерне).
Несколько позже были предложены другие сходные технологии: DAF (DNA Amplified Fingerprinting) и УП ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами). Все описанные методики различаются размерами праймеров (10-12 нуклеотидов в случае RAPD, около 20 нуклеотидов в случае AP-PCR, 7-8 нуклеотидов в случае DAF и 25-27 нуклеотидов в случае УП-ПЦР), их составом (от 50 до 80% ГЦ-пар), температурой отжига и методами выявления продуктов реакции (окрашивание бромистым этидием, радиоавтография, серебрение).
RAPD-анализ может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что особенно актуально для малоизученных таксономических групп. Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных. RAPD применяется также для геномного маркирования в популяционных и эволюционных исследованиях. Например, для разных видов грибов с помощью УП-ПЦР показана видоспецифичность ДНК-паттернов. Наиболее подробно с помощью RAPD-PCR изучались культурные растения, cельскохозяйственные и лабораторные животные с целью идентификации и дифференциации пород и отдельных линий, картирования хромосом и маркирования хозяйственно-ценных признаков. Показаны ассоциации некоторых RAPD-маркеров с генами резистентности к различным болезням у растений.

К недостаткам метода следует отнести низкую воспроизводимость результатов, обусловленную повышенной чувствительностью к условиям реакции: концентрации ионов магния, соотношению праймер/матрица, температурному режиму. Тем не менее RAPD-анализ может быть использован как экспресс-метод выявления генетического полиморфизма и как источник уникальных локус-специфичных маркеров.

Для получения локус-специфичных маркеров интересующий исследователя фрагмент экстрагируют из геля, клонируют и секвенируют. На основе полученного сиквенса подбирают праймеры, которые амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводимости. Полученные таким способом вторичные маркеры названы SCAR-маркерами (Sequence Characterized Amplified Region). Многие из них кодоминантны и могут быть использованы как уникальные маркеры в различных областях исследований. Полиморфизм SCAR-маркеров может быть увеличен путем рестрикционного анализа ПЦР-продукта.

Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры)

Для исследования вариабельности генома в целом может быть также использован метод анализа AFLP. Этот метод также не требует ни предварительного клонирования, ни секвенирования ДНК. Особености этого подхода заключаются в использовании в качестве матрицы рестрицированных фрагментов ДНК, лигированных со специфическими олигонуклеотидными адаптерами, и проведении избирательной амплификации со специально сконструированными праймерами. Праймеры состоят из фиксированной части, содержащей последовательность, комплементарную адаптеру и сайту рестрикции использованной эндонуклеазы (~ 15 нуклеотидов), и короткого фрагмента (на 3'-конце) с произвольной последовательностью нуклеотидов (2-4 нуклеотида). Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую воспроизводимость метода, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигированных фрагментов, которые могут быть амплифицированы. С каждой парой праймеров амплифицируется 75-100 фрагментов (AFLP-финргерпринтинг), которые разделяют в агарозном или полиакриламидном геле. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт, количество локусов, анализируемых одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа полиморфизма ДНК. С одного геля обычно удается получить до 40 полиморфных локусов. Этот тип полиморфизма ДНК также имеет доминантный тип наследования. AFLP-маркеры часто наследуются как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров, что позволяет, используя этот подход, быстро генерировать сотни высоковоспроизводимых маркеров. AFLP-маркеры были успешно использованы для геномного картирования, в популяционных и филогенетических исследованиях. В последние годы эти маркеры получают все более широкое распространение для исследования мало изученных таксономических групп.

Загрузка...

ISSR. Для создания ISSR-маркеров используют праймеры, комплементарные микросателлитным повторам (4-12 единицам повтора) и несущие на одном из концов последовательность из двух-четырех произвольных нуклеотидов (так называемый "якорь"). Такие праймеры позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микросателлитными последовательностями (как правило, это уникальная ДНК). В результате амплифицируется большое число фрагментов, представленных на электрофореграмме дискретными полосами (ISSR-фингерпринтинг). Полученные паттерны ПЦР-продуктов видоспецифичны. ISSR-маркеры также относятся к маркерам доминантного типа наследования, полиморфизм которых тестируется по наличию/отсутствию полосы. Аналогично RAPD и AFLP для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК. Метод обладает хорошей воспроизводимостью и наряду с AFLP может быть с успехом использован для выявления межвидовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации видов, популяций, линий, а в ряде случаев и для индивидуального генотипирования. ISSR-маркеры могут быть использованы также для картирования геномов и маркирования хозяйственно-полезных признаков.


Дата добавления: 2015-04-26; просмотров: 3 | Нарушение авторских прав

<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Мономорфные ДНК-маркеры| Микросателлиты

lektsii.net - Лекции.Нет - 2014-2019 год. (0.03 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав