Читайте также:
|
Лекція № 9
Белки, ферменты, ДНК-маркеры. Классификация, особенности применения.
Главными достоинствами молекулярных маркеров, в сравнении с морфологическими, обычными биохимическими и др., являются генотипичность, неопосредованность плейотропией и кодоминантность в наследовании, т.е. наличие у них главных атрибутов идеального генетического маркера. Они представляют собой биологические молекулы, способные, будучи изолированными, сохранять одно из важнейших элементарных свойств живого организма − биологическую специфичность.
Последняя проявляется в категориях таких явлений и свойств живой субстанции, как структурные соответствия, комплементарность и биологическое узнавание.
Биологическая специфичность по структурному соответствию оценивается физико-химическими методами, чаще всего электрофорезом в геле по подвижности биомолекул или их фрагментов. В случае оценки подобия белков главную роль в разделении компонентов играют заряд, структура и размер молекул, в оценке подобия фрагментов ДНК в рестрикционном анализе − только размер (длина) рестрикта, поскольку заряд и структура молекулы ДНК на всем ее протяжении примерно одинаковы. Специфичность ДНК в целом или в ее отдельных областях генома оценивается по полиморфизму длины рестриктов, на чем основан метод ПДРФ-маркеров.
На свойствах узнавания между молекулами основаны этапы матричного синтеза биологических молекул, взаимодействие фермента и субстрата, антигена и антитела, “самосборка” из субъединиц надмолекулярных биоструктур и сложных ансамблей, включающих, кроме белков, также липиды, углеводы и другие вещества. Принцип узнавания действует и на более высоких уровнях организации − в отношениях между ядром и цитоплазмой, в адгезиях клеток, в репродуктивной и морфогенетической совместимости видов и т.д.
Феномен биологического узнавания в генетических и филогенетических исследованиях растений мы реализовали в разных вариантах метода иммунохимии белков, основанного на использовании высокоспецифичной иммунологической реакции антиген − антитело. В подобных работах с нуклеиновыми кислотами комплементарность и узнавание, как известно, реализуются главным образом в разных приемах молекулярной гибридизации по типу ДНК-ДНК или ДНК-РНК с определением степени подобия, или гомологии, по количеству образовавшихся гибридных молекул. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот лежит в основе применения “проб”, или “зондов”, − молекул ДНК или РНК с известной нуклеотидной последовательностью, − для идентификации рестриктов геномной ДНК после разделения их электрофорезом.
При сопоставлении существующих методов маркирования в генетическом анализе обычно берут такие характеристики, как полиморфизм маркера, его молекулярная основа, стабильность наследования (генотипичность), число маркируемых локусов, возможности и техническая сложность, быстрота, доступность и экономичность. При этом в основном рассматриваются четыре типа маркеров: ферменты, запасные белки семян и ДНК-маркеров (ПДРФ- и ПЦР-технологии).
Некоторые авторы к молекулярным относят только ДНК-маркеры. Методологически это неверно. В маркировании биологических и генетических систем ферменты, запасные белки, белковые ингибиторы и др. используются не как простые биохимические соединения, а как структурно и функционально специфичные биологические молекулы, обладающие свойствами биологического узнавания, способностью к специфическому избирательному комплексированию и биологической интеграции.
Как уже отмечалось, главные атрибуты молекулярных маркеров − генотипичность, неопосредованность плейотропией и кодоминантность в наследовании. Эти свойства в равной мере присущи белкам и ДНК. Особенно отчетливо они выражены у кодирующей части ДНК, в ее генных локусах, которые в главном потоке генетической информации (ДНК − РНК − Белки − Морфогенез) служат ее первичным источником. Некодирующая часть ДНК играет вспомогательную − регуляторную, стабилизирующую и т.д. − роль, и ее маркерные свойства обусловлены главным образом специфичностью структурной организации, выраженной в нуклеотидных последовательностях и характере размещения повторов.
Кодирующие локусы генома через белки дают прямую информацию о признаках и могут быть их непосредственными, или прямыми, маркерами; некодирующие − лишь косвенными − через кодирующие локусы или общую структуру генома; до выяснения функций в геноме маркерное значение их устанавливается эмпирически.
Молекулярно-генетическое маркирование, основанное на использовании ДНК, получило бурное развитие, особенно за последнее десятилетие. Два главных его метода − ПДРФ и ПЦР − описаны в ряде публикаций. Кроме общих для молекулярных маркеров атрибутов преимущество ДНК-маркеров состоит в том, что для маркирования может быть использована ДНК любого органа и на любой стадии развития. В клетке ДНК собрана в обособленные структуры, − представлена центральным геномом, локализованным в ядре, и вспомогательными геномами митохондрий и пластид. В этих геномах ДНК выступает как бы в роли центров генетической информации на все совершающиеся в клетке метаболические и формообразовательные процессы. Для маркерной роли она как бы создана природой специально. Нуклеиновые кислоты и особенно ДНК выделяются среди других биологических субстанций исключительно высокой способностью к избирательным, специфическим взаимодействиям, основанным на свойствах молекул узнавать комплементарные структуры; в живых системах эти свойства выступают как функции биологического узнавания. Они лежат в основе матричного синтеза нуклеиновых кислот и всех молекулярно-генетических процессов, связанных с воспроизведением генетического материала и передачей генетической информации на синтез белка.
Некоторые исследователи отдают предпочтение ДНК-маркерам еще и на том основании, что белковые признаки отражают у высших организмов лишь небольшую часть генома, примерно 5-10%, что соответствует количеству ДНК структурных генов, непосредственно кодирующих белки. Как уже отмечалось, остальная часть геномной ДНК, т.е. 90-95%, выполняет регуляторную и вспомогательную роль.
Здесь, однако, необходимо отметить следующее: белки маркируют наиболее существенные локусы, составляющие эти 5-10% генома. К тому же “служебные”, некодирующие, области ДНК в функциональном отношении изучены еще очень слабо. Но то, что мы знаем о них, уже свидетельствует о направленности их участия на обеспечение генетической и биологической специфичности организма через синтез белков. Другими словами, как ингредиенты генома, представляющего собой генетическую систему видовой категории, некодирующие области, безусловно, в роли регуляторов и кофакторов непременно участвуют в видоспецифичном синтезе белков и формировании соответствующих родовых, видовых, сортовых и других белковых признаков.
Поскольку генетическая информация, заключенная в геноме, реализуется в метаболизме и морфогенезе только через белки, приоритет за ними как генетическими и филогенетическими маркерами, надо полагать, сохранится и тогда, когда будут разгаданы все функции генома и геномной ДНК.
Пока что преимущества ДНК-маркеров типа ПДРФ и ПЦР по разрешающей способности различать генотипы обусловлены подбором проб, или зондов, для выявления нужных рестриктов, или фрагментов геномной ДНК, в электрофоретическом спектре на агарозном геле. Такими пробами чаще оказываются некодирующие и даже случайные, иногда анонимные ДНК-последовательности, благодаря чему анализ сорта на генотипный состав или оценка на полиморфизм оказываются в той или иной мере обезличенными, “анонимными”, и по своему значению соответствуют простым меткам, или “отпечаткам пальцев”. Естественно, результаты рассматриваемых методов приобретают определенный смысл и конкретное содержание, когда пробой служит ДНК-последовательность, соответствующая конкретному генетическому локусу или некодирующей последовательности генома, генетическая или иная функция которой известна. Соответственно, значимость ПДРФ- и ПЦР-маркеров, основанных на использовании геномной ДНК, в генетическом и биологическом анализе растений будет возрастать по мере выяснения функциональной природы кодирующих и некодирующих локусов генома и совершенствования техники выделения соответствующих им фрагментов ДНК. Успехам в этом направлении будут способствовать работы по картированию генома и использование в качестве зондов строго определенных и методически наиболее удобных генных (возможно, и других смысловых) локусов. Это позволит подойти к стандартизации методов идентификации сортов, биотипов и генетических линий для создания единой системы регистрации генофонда сельскохозяйственных растений.
О сущности и возможностях белковых маркеров. Белки как первичные продукты кодирующих локусов геномной ДНК по маркерным возможностям фактически им не уступают, а по информативности даже превосходят.
Уже сравнительно давно, на заре становления молекулярной биологии, Б. Коммонер выразил сомнение относительно жесткости в понимании односторонней передачи информации (биохимической специфичности) от ДНК через РНК белкам.
Современные представления о взаимосвязи между генетическими, метаболическими и морфогенетическими процессами в организме и основополагающем значении в них белков дают основание утверждать, что последние теми или иными путями, например в качестве ферментов или их кофакторов, через метаболизм и морфогенез в конкретных условиях среды непременно вносят определенный вклад в развитие генетических систем, вызывая соответствующие сдвиги в структуре и генетических функциях геномной ДНК. Эти сдвиги зарождаются в белках в ходе их биосинтеза; они редки, но возможны, например во время транскрипции и трансляции, при сплайсинге и разнообразных посттрансляционных модификациях, имеющих место вплоть до мембранного транспорта и включения белковых молекул в биоструктуры.
Естественно, далеко не все возникающие при этом отклонения в структуре и функциях белка реализуются в сдвигах генома, а кардинальной изменчивости в нем скорее следует ожидать от изменений общей ситуации в метаболизме и морфогенезе, вызываемых сдвигами в белках.
Поскольку все названные выше этапы белкового синтеза генетически детерминированы, то “зрелая” молекула белка, вобравшая на пути своего становления дополнительную информацию, морфогенетически, т.е. структурно и функционально, оказывается, как правило, богаче, чем даже это мог бы обеспечить лишь кодирующий ее генетический локус генома.
Преимущество белковых маркеров состоит также в том, что сами они являются носителями тех или иных функций в метаболизме или морфогенезе и часто наряду с генами или локусами генома могут быть факторами идентификации этих функций. В большей мере это касается ферментов, функциональная специфичность у которых может быть особенно высокой. Их органная специфичность, динамичность в онтогенезе и значительная изменчивость по степени активности (редко по характеру или типу катализируемой реакции) в меняющихся условиях среды обитания организма требуют тщательного соблюдения правил взятия проб для анализа с учетом тканевой и органной принадлежности, а также фаз развития растения. Главные преимущества ферментов-маркеров − легкость их идентификации и простота трактовки результатов ферментного анализа.
По характеру генетического полиморфизма ферменты чрезвычайно разнообразны: среди них можно встретить как мономорфные − одиночные или множественные по числу электрофоретических компонентов, свойственных всем представителям какого либо вида, так и очень полиморфные, отражающие многоаллельность гена. При этом степень полиморфизма многих ферментов может меняться от вида к виду: мономорфные или низкополиморфные ферменты у одних видов растений могут оказаться полиморфными у других.
Оценка на полиморфизм перед началом генетического или филогенетического анализа по белковым маркерам необходима и по другим белкам.
Одним из критериев маркера является число маркируемых им локусов генома. Условно можно считать, что мономерные ферменты, представленные одной молекулой белка, точнее, одним полипептидом, маркируют один генетический локус, димерные ферменты, состоящие из двух разнокачественных полипептидов, маркируют два локуса; мультиферменты − многолокусны.
Ферменты как белковые маркеры могут быть использованы и как серологические маркеры для филогенетического анализа и выявления интрогрессий, и как электрофоретические маркеры для раскрытия внутривидовой дифференциации, сортовой идентификации и анализа популяций. Совокупность сведений о маркировании генома и других генетических систем по ферментам может дать конкретное представление о принципиальных основах организации этих систем в организме и ключ к расшифровке сущности практически всех генетически сложных биологических свойств и хозяйственных признаков растения, тем более, что ферменты наряду с генетическим маркированием сами по себе могут служить факторами идентификации тех или иных признаков. Без ферментов в организме не обходится ни одна биохимическая реакция, ни один метаболический процесс. На генетической карте генома они занимают значительную часть его кодирующих областей.
Совершенно очевидно, что ферменты со всей совокупностью изоферментных систем и их белковых кофакторов представляют собой в молекулярной биологии важнейшую область биологического и генетического маркирования организма с большим числом его теоретических и практических аспектов для многостороннего использования.
Среди белковых маркеров у растений особое положение занимают запасные белки семян − проламины злаков и глобулины двудольных. Они высокополиморфны, хотя имеются и хорошо выраженные мономорфные компоненты, удобные для филогенетического анализа. Сфера их маркирования ограничена двумя-четырьмя хромосомами, включающими несколько десятков генетических локусов генома. У злаков наиболее множественны и полиморфны неагрегированные спирторастворимые проламины - глиадины, секалины, гордеины, которые дают возможность, однако, с достаточной полнотой идентифицировать существующий генофонд сортов зерновых злаков, различать и регистрировать их биотипы, инбредные линии и с большой детализацией анализировать сортовые, гибридные и естественные популяции.
Семена содержат также ферменты, их ингибиторы и многочисленные ядерные и цитоплазматические конституционные белки, усиливающие и расширяющие маркерные возможности запасных белков. В кодировании всей совокупности белков семян, доступных иммунохимическому или электрофоретическому анализу, участвуют все хромосомы генома.
Соответственно, белки семян как генетические и филогенетические маркеры охватывают подавляющую часть генома и особенно те его области, которые детерминируют продуктивность растений по зерну и определяют качество урожая, включая такие главные хозяйственные признаки, как масличность или белковистость зерна, выход и свойства клейковины, хлебопекарные качества муки, а также другие питательные или кормовые достоинства урожая.
Главные достоинства запасных белков семян как маркеров состоят в следующем.
1. Они содержатся в семени или зерне в большом количестве, локализованы в морфогенетически однородной ткани (семядолях или эндосперме), легко доступны выделению и последующим иммунохимическим или электрофоретическим анализам, интерпретация результатов которых проста и конкретна.
2. Белки зрелых семян представляют собой как бы строго фиксированную фазу их динамики в онтогенезе; морфогенетически они однородны.
3. Другие белки семени, находясь в той же фазе функционального состояния, могут быть использованы как дополнительные или вспомогательные маркеры в тех случаях, когда разрешающая способность запасных белков окажется недостаточной. Такими белками могут быть ферменты, их белковые ингибиторы и высокомолекулярные агрегированные проламины, т.е. субъединицы глютенина зерновки злаков. Учитывая повсеместно действующий фактор, или феномен “функционального сцепления” генов и генетических систем, можно считать, что белки семени в совокупности могут обеспечить довольно полное маркирование локусов, ответственных за генетическую и филогенетическую изменчивость не только в сфере семян, но и всего растения.
4. Семена − самый доступный и удобный источник белковых маркеров и очень важный объект для решения методами белковых маркеров различных задач частной генетики, селекции, сортоиспытания, семеноводства и семенного контроля сельскохозяйственных растений, чем мы были заняты на протяжении последних трех десятилетий. За это время мы убедились, что белки семян в не меньшей, а иногда и в большей мере эффективны и полезны, чем другие молекулярные маркеры для биологического анализа растений при решении таких проблем, как идентификация вида и генома, геномный анализ, выяснение путей происхождения культурных растений и степени родства их с дикимисородичами, аллополиплоидия как один из способов видообразования и морфогенеза у растений, молекулярно-биологическая сущность и генезис такого генетически и морфогенетически сложного признака, как хлебопекарные свойства муки пшеницы и родственных ей злаков.
Сказанное о свойствах и возможностях белковых маркеров можно суммировать следующим образом:
− как первичные продукты генетических систем белки маркируют структурные гены непосредственно, в то же время они маркируют тандемно и функционально связанные с ними гены и генетические системы;
− в силу биологической специфичности белки отражают принадлежность растения виду, роду и т.д. и соответственно являются “филогенетическими маркерами”, а в силу функциональнойспецифичности они могут быть “ метаболическими” или “морфогенетическими маркерами”;
− белки позволяют идентифицировать геном как генетическую систему видовой категории, поэтому могут быть “маркерами генома”;
− белки дают возможность выявлять (выделять, различать) три основные категории наследственной изменчивости растений: аллельную, генную и геномную;
− в силу зависимости кодирующего гена от “генетической среды” и возможности других сдвигов в генотипе, например при сплайсинге, вторичных (посттрансляционных) модификациях и т.д., белковый маркер несет более богатую генетическую информацию, чем кодирующий его ген;
− в главном потоке генетической информации белок − начало и основа метаболизма и морфогенеза, поэтому он является самым надежным критерием в оценке функционального значения его маркирующего гена.
Больших преимуществ следует ожидать от сочетания методов ДНК-маркеров с принципами и методами белковых маркеров.
Перечисленные выше свойства и возможности белков как факторов идентификации генетических систем и молекулярно-биологического анализа растений позволили нам решать, можно сказать, важнейшие проблемы прикладной ботаники, генетики и селекции.
В сочетании с другими методами биохимического и молекулярно-биологического анализа электрофорез белков сыграл большую роль в разработке таких проблем как аллополиплоидия, гетерозис и сложные признаки растений. Особенно большую роль разные варианты этого метода сыграли в решении практических задач растениеводства. Как оказалось, многие задачи генетики и проблемы селекции могут быть успешно решены только с привлечением белковых маркеров. Так, например, только по электрофоретическим спектрам полиморфных белков возможен анализ морфологически однородных популяций. Только белковые маркеры позволяют исключать гетерозиготные растения на первых этапах семеноводства и сохранять характерные для сорта соотношения морфологически неразличимых генотипов в популяциях, что особенно важно при ускоренном способе выращивания элиты для быстрейшего внедрения в производство новых районированных и дефицитных сортов.
Пока только по белковым маркерам возможна прямая оценка семян на гибридность F1 в семеноводстве гетерозисных гибридов, полностью заменяющая дорогостоящий, трудоемкий и малоэффективный грунт-контроль.
В настоящее время складываются технологии выделения биотипов из сортов самоопыляющихся культур и получения инбредных линий из сортовых популяций перекрестников на основе электрофоретического анализа маркерных белков единичных зерновок с сохранением их жизнеспособности. Как элемент селекционного процесса эта технология должна занять достойное место в ряду современных вспомогательных средств селекции. Ее преимущества, например, перед клеточной селекциейили методами дигаплоидов в получении инбредных линий, состоят прежде всего в том, что, во-первых, селекционер здесь работает с нормальными, естественными, стабильными (неповрежденными) генетическими системами, во-вторых, он имеет возможность контролировать селекционный процесс и использовать в селекции весь генофонд сорта, популяции или вида в целом.
Методы белковых маркеров могут быть использованы (и уже используются) в сочетании с любыми методами селекции и на всех этапах селекционного процесса − от изучения исходного материала и поиска источников до сортоиспытания и семеноводства созданных сортов, а именно:
в изучении исходного материала: филогенетический анализ, идентификация генома, оценка геномного состава полиплоидных видов, идентификация сортов, биотипов и линий, регистрация генетических ресурсов селекции, анализ морфологически однородных естественных и сортовых популяций, создание вспомогательных систем селекции, поиск источников ценных признаков;
в селекции: отбор ценных генотипов по белковому фенотипу, анализ гибридных популяций, контроль за включением желаемых генетических систем (геномов, хромосом и их локусов) в создаваемые сорта, гибриды и аллоплоиды, получение многолинейных сортов-популяций и сортов-синтетиков, подбор родительских форм и видов-посредников при отдаленной гибридизации, контроль полноты насыщающих скрещиваний;
в сортоиспытании: определение происхождения и оригинальности сорта, оценка на генетическую однородность и константность, оценка состава сортовых популяций у перекрестников и биотипного состава сортов самоопылителей, регистрация и документация районированных сортов в виде “белковых формул”;
в семеноводстве и семенном контроле: проверка типичности при отборе лучших растений в первичном семеноводстве, выяснение природы нетипичных растений для подготовки рекомендаций апробаторам, тест на наличие спонтанного переопыления и механического засорения, контроль за составом популяций при улучшающем семеноводстве перекрестников, маркирование линий в семеноводстве гибридных семян и оценка последних на уровень гибридности; быстрое серологическое и электрофоретическое обнаружение засоренности зерна твердой пшеницы зерном мягкой, различение фатуоидов и овсюга, определение подлинности и чистоты трудноразличимых по морфологическим признакам семян бобовых и крестоцветных;
в клеточной и хромосомной инженерии: маркирование клеточных линий и очагов дифференциации каллюса, хромосомных преобразований и идентификация генетического материала в соматических гибридах; в генной инженерии: поиск в геноме локусов и генетических систем, кодирующих биологические свойства и хозяйственные признаки растения, оценка генной функции выделенных фрагментов ДНК генома или плазмона.
Дата добавления: 2015-04-26; просмотров: 85 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |
| Молекулярні маркери. | | | СТАРЕНИЕ И ГИБЕЛЬ КЛЕТОК. |