Читайте также:
|
Слюну разбавляют водой, часть жидкости кипятят, отлив в пробирку; амилаза слюны при этом необратимо инактивируется. В 2 пробирки приливают по 5 мл 1% р-ра крахмала и затем в одну из них добавляют не прокипяченную, а в другую прокипяченную слюну. Обе пробирки ставят на водяную баню при 37°C и через 15 минут в каждую из них прибавляют по 1-2 капли раствора йода в йодистом калии.
В пробирке с не прокипяченной слюной синяя окраска не проявляется, т.к. крахмал под действием амилазы расщепился. В пробирке с прокипяченной слюной появляется синяя окраска, обусловленная присутствием крахмала. Крахмал в последнем случае не расщепился, т.е. амилаза инактивирована кипячением.
Специфичность ферментов:
Ферменты характеризуются высокой специфичностью действия. Например, фермент амилаза расщепляет крахмал, но не действует на другой углевод – сахарозу.
Для этой работы в 4 пробирки помещают: 1 - крахмал и амилазу: 2 – крахмал и фруктофуранозидазу: 3 – сахарозу и фруктофуранозидазу: 4 – сахарозу и амилазу.
Пробирки встряхивают и ставят на водяную баню при 37°C на 15 минут, после чего в каждую пробирку добавляют реактив Фелинга и нагревают. В пробирках 1 и 3 появляется красный осадок, что свидетельствует о расщеплении крахмала под действием амилазы, и сахарозы под действием фруктофуранозидазы. В пробирках 2 и 4 реакция отрицательна. Это показывает, что крахмал не расщепился фруктофуранозидазой, а сахароза – амилазой.
Крахмал и сахароза дают отрицательную реакцию Фелинга, т.к. не обладают всасывающими свойствами. При ферментативном гидролизе крахмала образуется дисахарид – мальтоза, при гидролизе сахарозы – моносахариды: глюкоза и фруктоза. Мальтоза, фруктоза и глюкоза содержат свободные карбонильные группы и поэтому обладают способностью восстанавливать окисную медь, входящую в состав реактива Фелинга, в закисную медь, при нагревании образующую осадок красного цвета.
Зависимость действия ферментов от pH
Ферментативные реакции лучше всего протекают при оптимальной концентрации ионов водорода в растворе. При небольшом отклонении от оптимума pH, скорость ферментативной реакции замедляется. При резком отклонении реакция прекращается совсем.
Для исследования изменения активности амилазы слюны в зависимости от pH в 5 пробирках готовят лимонно-фосфатные буферные смеси со следующими значениями pH:
| 4,6 | 6,2 | 6,8 | 7,4 |
К 10 мл приготовленных смесей добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 1 мл раствора слюны, разбавленной водой в 100 раз. Содержимое пробирок встряхивают и ставят на водяную баню при 37°C.
Через каждые 5-10 минут из пробирки № 3 берут несколько капель в фарфоровую чашечку и смешивают с раствором йода в йодистом калии. Оптимум pH для амилазы слюны 6,8. Следовательно, наиболее быстрого расщепления можно ожидать в пробирке № 3.
Расщепление крахмала до мальтозы под действием амилазы слюны происходит через ряд промежуточных продуктов, называемых декстринами и дающих различную окраску с йодом.
Крахмал дает синюю окраску с йодом, а декстрины - фиолетовую, фиолетово-красную, красно-бурую, желтую, и продукты глубокого гидролиза, в частности мальтозы, не дают окраски с йодом.
Появление красно-бурой или желтой окраски укажет на близкий конец гидролиза в пробирке № 3.
При прошествии 2-3 минут с момента появления подобной окраски все пробирки вынимают из водяной бани, ставят в стакан с холодной водой и быстро добавляют в каждую пробирку по 2-3 капли раствора йода. По появлению той или иной окраски с йодом судят о степени гидролиза крахмала в зависимости от pH.
Оформить отчет в тетради.
Лабораторная работа № 7
«Проведение гидролиза нуклеотидов селезенки,
качественное открытие в гидролизе компонентов нуклеиновых кислот»
Цель работы: Ознакомление с реакциями гидролиза нуклеопротеидов.
Материальное обеспечение: Фарфоровая ступка с пестиком, стакан, центрифуга, мерный цилиндр, деревянная палочка (стеклянная), пробирки, пипетки на 2 мл, водяная баня.
Реактивы: Селезенка, молярный раствор хлористого натрия, 0.4 % р-р едкого натра, дифениламиновый реактив.
Формирование компетенций: ОК-1, ОК-4, ПК-1.1, ПК-1.2, ПК-2.2, ПК-6.1.
Ход работы:
Выделение нуклеопротеидов из тканей: в ступке с песком растирают измельченную селезенку (на 1 часть берут примерно 1 часть промытого прокаленного песка) и обрабатывают растертую массу 20 – кратным количеством молярного раствора хлористого натрия, который добавляют небольшими порциями при тщательном растирании. Полученный вязкий раствор отделяют от остатка центрифугированием. Центрифугат сливают в мерный цилиндр и др. В стакан наливают в 6 раз больше воды, чем получилось в центрифуге. Помещают в стакан с водой стеклянную палочку и при медленном перемешивании вливают в воду центрифугат. При этом на палочку наматывают нити нуклеопротеида, которые переносят в пробирку или колбочку и растворяют в небольшом количестве 0.4% р-ра едкого натра.
Реакция на нуклеиновую кислоту. К 1 мл р-ра нуклеопротеида добавляют дифениламиновый реактив до растворения, образующегося вначале осадка, и нагревают в водяной бане 15-20 минут. Появление синей или зеленой окраски зависит от присутствия в молекуле нуклеопротеида углевода, являющегося составной частью нуклеиновой кислоты.
Оформить отчет в тетради.
Лабораторная работа № 8
Дата добавления: 2015-04-26; просмотров: 28 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |
| Реакции Балласа и Подобедова. | | | Ознакомление с качественными реакциями |