Читайте также:
|
Цель: Изучить механизм постановки серологических реакций с
метками и ПЦР для экспресс - диагностики инфекционных
заболеваний.
Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция.
Иммунитет.
Содержательный модуль 9. Реакции иммунитета. Иммунопатология.
Тема занятия № 18. Серологические реакции с меткой. Полимеразная цеп-ная реакция.
Актуальность темы. Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Индикация образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и др. метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких минут.
Исторически первым среди них был радиоиммунологический анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов прошлого века. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 125I, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл).
Радиоиммунный метод, является наиболее информативным, основан на исследовании характера взаимодействия антитела с антигеном с образованием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или антитело) введена радиоактивная метка. Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические антитела меченного радиоактивным изотопом антигена и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде. С этой целью в исследуемую жидкость, в которой предполагается наличие антигена, добавляют известное количество такого же меченного антигена и стандартное количество антисыворотки с соответствующими антителами. Если в исследуемой жидкости отсутствует искомый специфический антиген, то около 70–80% меченного антигена связывается с антителами, обусловливая высокую радиоактивность образующегося преципитата. Если же в биологической среде присутствует искомый антиген, он конкурирует с меченным антигеном и связывает часть антител. В результате радиоактивность преципитата падает по сравнению с контролем. На этом принципе основано количественное определение антигенов или антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась не связанной в результате конкуренции с выявляемым не меченым антигеном. При определённых концентрациях количество меченого антигена, связавшегося с антителами, обратно пропорционально количеству определяемого антигена. После взаимодействия антигенов с антителами образовавшийся комплексы антиген – антитело отделяют от свободного меченого антигена. Способы отделения: 1.Электрофорез; 2. Гель – фильтрации; 3.Фракционного осаждения иммунного комплекса этанолом и др. Отделив меченый антиген от комплекса антиген – антитело определяют количество меченого антигена, связавшегося в комплексе по количеству импульсов (сцинтилляционным счетчиком). Уменьшение количества импульсов в единицу времени в сравнении с соответствующими контролями свидетельствует о присутствии гомологичного меченого антигена, связанного с антисывороткой, в результате чего антиген не вступил в реакцию и не определяется в комплексе антиген – антитело.
В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях.
На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Наибольшее распространение получили гетерогенные методы иммуноферментного анализа, основанные на использовании полистироловых планшетов для иммобилизации антител или антигенов, специфическом связывании определяемого вещества на стенках лунок планшета и последующем выявлении образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов.
Иммуноферментный метод основан на учете реакции антиген-антитело, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу, щелочную фосфатазу. Одним из распространенных вариантов таста ИФА является твердофазный метод «Сэндвич – метод»: вначале на стенках полистироловых пробирок сорбируют антитела против определенного антигена. В эту же пробирку вносят исследуемый биологический образец. Если там содержатся искомые антигены, они взаимодействуют с антителами и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. После этого в пробирку вводят антитела к данному антигену, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н2О2) и хромогены. Фермент (пероксидаза) разлагает Н2О2 с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и, соответственно, количество искомого антигена оценивают фотометрически.
Этапы проведения ИФА:
1. Инокуляция биоматериала и реактивов в лунки полистироловых планшетов микротест системы (на которых сорбированы Ат против определенного Аг и фермент).
2. Термостатирование и встряхивание на шейкере для равномерного перемешивания реакционной смеси в лунках планшета.
3. Промывка лунок планшета на вошере (автоматический промыватель планшетов) – для отмывки не связавшихся субстанций (Ат, конъюгата и др.).
4. Добавление окрашенного субстрата (хромогена).
5. Регистрация результата на ридере (спектрофотометре, фотоколориметре для определения оптической плотности исследуемого раствора в лунках планшета).
В последние годы для количественного радиоиммунного и иммуноферментного определения различных антигенов и антител в биологических средах все чаще используют так называемые моноклональные антитела. Последние получают не путем иммунизации животных, а искусственно, путем синтеза так называемых моноклонов, т. е. культуры клеток, происходящих из одного сенсибилизированного лимфоцита. Моноклональные антитела отличаются от обычных антител, полученных с помощью классической иммунизации животных, очень высокой специфичностью и реагируют только на определенный антиген.
Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворотке является реакция иммунофлюоресценции (РИФ) -люминисценция в ультрафиолетовом свете микроскопа биологического объекта, содержащего излучаемый антиген после его предварительной обработки специфическими антителами, меченными флюорохромом.
Суть метода заключается в том, что локализация антигена в препарате обнаруживается по специфической флюоресценции в месте реакции антиген – антитело. Метод основан на использовании явления люминисценции для выявления реакции антиген – антитело, происходящей на поверхности клеток или на срезах ткани. При этом антитела, связанны с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. Большое преимущество метода заключается в его простоте, высокой чувствительности, а так же в быстроте получения результатов. Метод был предложен в 1942 г. Кунсом. Специфический белок метят флюорохромами – это такие красители, которые способны поглощать свет и излучать его через короткий промежуток времени (10-6 – 10-9сек). Интенсивность флюоресценции пропорциональна интенсивности возбуждающего излучения, и при малых концентрациях вещества возможно количественно определить флюоресцирующее вещество на микроскопическом или цитологическом препарате.
Механизм реакции: происходит конъюгация белка с флюорохромом, которая является по своей сути химической реакцией, в результате чего образуется новое соединение, в котором краситель присоединяется к белку ковалентной связью. В реакции участвуют в основном ε – аминогруппы лизина и концевые аминогруппы белковой молекулы.
Метод применяется в трёх основных модификациях:
1.При прямом методе (Кунс и Каплан) на препарат, содержащий искомый антиген, наносят специфическую люминисцентную сыворотку (антитело). После реакции препарат промывают и изучают в люминисцентном микроскопе. Таким образом, реакция протекает одноэтапно.
2. При непрямом варианте РИФ (Уэллер и Кунс). Раствор немеченных антител наносят на срез (ткань различных органов животных, содержащих известные антигены), а затем выявляют их при помощи меченных флюорохромом антииммуноглобулиновых антител.
3. Непрямой метод с комплементом (Гольдвассер, Шепард). Этот вариант метода разработан для определения комплемент – связывающих антител. После обработки среза антителами на него наносят в качестве источника комплемента свежую сыворотку. Комплемент связывается в участках, где фиксированы антитела. В результате эффекта усиления при активации комплемента по классическому пути одна молекула антител может вызывать связывание многих С3 – молекул на срезе; их выявляют, обрабатывая срез флюоресцентно меченными антителами анти-С3. Препараты изучают в люминисцентном микроскопе (ЛЮМАМ).
В современной медицинской практике с каждым годом возрастает роль лабораторной диагностики как основного инструмента постановки диагноза и мониторинга терапии. Одним из бурно развивающихся и востребованных методов лабораторной диагностики является иммунохроматографический анализ (ИХА) - метод одноэтапного быстрого качественного определения наличия антител к возбудителям заболеваний in-vitro в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА - метод сухой иммунохимии, стрип-тест, экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа.
Принцип действия ИХА с помощью полосок состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости. Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения. В ИХА- тестах используется три типа антител:
1. Растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные ("сшитые") с коллоидным золотом - красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь).
2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски.
3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.
Принцип действия ИХА с помощью тест - кассет, состоит в том, что исследуемый образец абсорбируется поглощающим участком планшета. При наличии в анализируемом образце антител к возбудителю заболевания последние вступают в реакцию с протеином А, конъюгированным с частицами коллоидного золота, образуя окрашенный комплекс. Этот комплекс движется по мембране и связывается с рекомбинантным антигеном, иммобилизованным на мембране в тестовой зоне планшета, образуя полоску розово-фиолетового цвета на уровне маркировки Т (Test). Остальные компоненты образуют полоску розово-фиолетового цвета в тестовой зоне на уровне маркировки С (Control). Результаты реакции оцениваются визуально в течение 10 минут. В том случае, когда концентрация антител к возбудителю заболевания в анализируемом образце сыворотки крови равна пороговому уровню или превышает его, в тестовой зоне выявляются две полоски розово-фиолетового цвета на уровне маркировок Т и С.
Основными преимуществами использования иммунохроматографического анализа являются:
§ Простота и удобство - позволяет получить результат (анализ и первичное представление о причине заболевания) без оборудования и специальных навыков
§ Надежность - достоверность тестов достигает 92-99,8%, при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль
§ Экономичность - минимальные затраты на приобретение теста и экономия времени на проведение обследования. В рознице стоимость одного ИФА-исследования в 5-10 раз дороже ИХА и получение результата минимум на следующий день
§ Анонимность - что особенно важно при выявлении заболеваний, передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также выявлении фактов употребления наркотических веществ
§ Независимость - не требует предварительной медицинской консультации и рецепта врача
Высокочувствительным методом, основанном на сочетании электрофореза и ИФА (или РИА) является иммуноблоттинг (Вестерн-блонттинг) с помощью которого проводится идентификация исследуемых антител после электрофоретического разделения их и последующего тестирования с помощью меченных антивидовых антител.
1. Иммуноблот с РИА. Антигены возбудителя (исследуемые антигены) сначала разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Полученные фракции переносят (блоттинг – от англ. blot – пятно) электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану, которая помещается в специальную камеру. Затем эти блоты обрабатывают специальными Ат к специфическому Аг, отмывают и добавляют радиоактивно меченный конъюгат для определения связавшихся с Аг Ат. Блоты помещают в кассету с рентгеновской пленкой и на проявленной пленке при положительной реакции видны полосы локализации Аг, связавшего меченные Ат.
2. Иммуноблот с ИФА. Фирмы выпускают коммерческие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации, отмывают от несвязавшихся Ат больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.
При наличии в исследуемой сыворотке крови специфических антител к индивидуальным белкам возбудителя образуется видимый преципитат. Положительные реакции выглядят в виде ИФА – пятен, каждое из которых соответствует дискретной паре антиген – антитело. Единственное пятно позволяет усомниться в истиности результата.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это амплификация специфических последовательностей нуклеиновых кислот, с помощью которой в течение нескольких часов можно размножить нужную последовательность в миллионы раз. ПЦР позволяет осуществить такую амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы из 4 дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, являющихся структурными элементами любой ДНК, и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3´-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена.
ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации - изолированное умножение гена или его фрагмента) специфической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – так называемых праймеров. Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле. Метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий ДНК в исследуемом материале. Данный метод основан на выявлении в исследуемом образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей.
Достоинство:
1.Высокая чувствительность, позволяющая выявить даже единичные клетки возбудителя, независимо от их природы за 1-2 часа.
2.Высокая специфичность – выявляется характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.
3.Быстрота получения результата – весь процесс занимает 3-4 часа.
4.Использование при определении возбудителя непосредственно клинического материала, без специального выделения чистой культуры возбудителя и его подращивания.
5.Диагностика не только свежих, но и хронических форм инфекций. Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых и персистирующих форм патогенных микроорганизмов.
6.Возможность выделения ДНК не только живых, но и убитых микроорганизмов.
Стадии метода ПЦР:
І. Выделение ДНК возбудителя из биологического материала.
ІІ. Амплификация ДНК (многократное копирование специфического фрагмента ДНК) – проводится в термоциклерах «Терцик – Украина» - специальный прибор с определенным температурным режимом для проведения циклов ПЦР, каждый из которых состоит из 3-х этапов:
1. Денатурация – нагревание реакционной смеси до 93-950С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.
2. Отжиг (присоединение) – при наличии искомой ДНК-мишени праймеры отжигаются (присоединяются) к ДНК-мишени при температуре 600С. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа (напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина – цитозин). Когда отжиг праймеров произошел, Таq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК.
3. Синтез (элонгация) – доводят температуру в реакционной смеси до оптимума работы фермента (720С). Синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью. В дальнейшем этап денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются до 30 и более раз. На каждом температурном цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается. Таким образом, данный метод основан на способности ДНК-полимеразы достраивать одноцепочечную ДНК с образованием двухцепочечной молекулы.
Праймеры – короткие искусственно синтезируемые молекулы ДНК, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени.
Taq-полимераза – фермент, обеспечивающий достраивание второй цепи ДНК
ІІІ. Детекция продуктов амплификации. Продукты ПЦР (ампликоны) идентифицируют при помощи гелевого электрофореза и результат реакции учитывают по свечению искомой ДНК возбудителя в УФ свете с помощью прибора - трансиллюминатора.
Конкретные цели:
· Объяснить преимущества применения серологических реакций с метками как экспресс – методов диагностики инфекционных заболеваний;
· Объяснить суть реакций и механизм проведения серологических реакций с метками;
· Проанализировать механизм проведения иммуноферметного анализа и сравнить с иммунохроматографическим анализом;
· Сравнить преимущества и недостатки ИФА и ИХА;
· Описать механизм проведения полимеразной цепной реакции;
· Изучить этапы проведения ПЦР;
· Перечислить достоинства ПЦР.
Уметь:
· Пояснить необходимость проведения серологических реакций с метками;
· Описать этапы проведения реакций с метками;
· Проанализировать механизм проведения РИА, ИФА и ИХА;
· Трактовать результаты серологических реакций с метками;
· Трактовать результаты ПЦР;
· Анализировать полученные результаты.
Теоретические вопросы:
1. Определение понятия «серологические реакции с метками».
2. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение.
3. Иммуноферментный анализ, иммуноблотинг. Механизм, компоненты, применение.
4. Механизм проведения радиоиммунного анализа.
5. Иммунохроматографический анализ. Принцип проведения.
6. Механизм полимеразной цепной реакции. Этапы проведения. Учет.
Практические задания, которые выполняются на занятии:
1. Разбор схемы постановки ИФА.
2. Разбор схемы постановки ИХА.
3. Оценка результатов реакций.
4. Разбор схемы постановки иммуноблоттинга.
5. Разбор схемы постановки РИА и РИФ.
6. Оценка результатов реакций.
7. Разбор схемы постановки ПЦР.
8. Оформление протокола.
Литература:
1. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с анг. – М.: Мир, 2000.– 592с., с ил.
2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник /Под ред. А.А. Воробъева.– М.: МИА, 2004.– 691с.: ил.
3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.
5. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для студентов медицинских ВУЗов /Под ред. А.А. Воробъева, А.С. Быкова.– М.: МИА, 2003.– 236с.: ил.
6. Сучасні методи лабораторної діагностики інфекційних захворювань: Навч. посібник /За ред. акад. А.Я. Циганенка. Харків: Вид-во “Основа”, 2003.– 88 с.
7. Конспект лекции.
Дополнительная литература:
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: М.: Медицинское информационное агенство, 2001. – 736 с.
2. Вершигора А.Е. Общая иммунология. - К.: Вища шк., 1990. - 635 с.
3. Воробьёв С.М., Северина Т.А. Создание иммуноферментной системы для определения гликопротеинов с использованием моноклональных антител // Биотехнология. - 1991.- № 4.- С. 82 - 85.
4. Егоров А.М., Осипов А.П. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая шк., 1991. - 288 с.
5. Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология: Руководство для врачей. - СПб: Питер, 2001. - 576с.
6. Иммунологические методы исследований /Швейцария. Базельский ин-т иммунологии; Под ред. И. Лефковитса, Перниса П.; Пер. с англ. - М.: Мир, 1988.- 527с.
Дата добавления: 2015-05-05; просмотров: 35 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |
| Будни и праздники сибиряков | | | Психология труда официанта |