Читайте также:
|
|
1. Для уменьшения погрешности надо готовить исходный раствор крови для записи спектра такой концентрации, чтобы его оптическая плотность в первой изобестической точке при λ=550 нм была не менее 0.5, а в максимуме при λ=540 нм – не более 0.9 – 1.0. На практике при недостатке визуального опыта готовят 0.5% раствор исследуемой крови в 0.1% растворе аммиака. Измеряют его оптическую плотность при λ=550 нм. Если она менее 0.5, то добавляют несколько капель исходной крови к полученному раствору (если надо, то несколько раз), пока оптическая плотность крови приλ550 нм не станет близкой к 0.5.
2. Уделить максимум внимания чистоте спектрофотометрических кювет и рук оператора. Лучше работать в резиновых напальчниках, т.к. потожировые выделения от рук на рабочих поверхностях кювет могут дать увеличение оптической плотности на 0,009.
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРБОКСИГЕМОГЛОБИНА (без насыщения)
Готовят 0,5% раствор исследуемой крови в 0,1% растворе аммиака, полученную смесь фильтруют через складчатый фильтр и снимают спектр в интервале от 500 нм до 600 нм на спектрофотометре, в кювете толщиной слоя 1 см, раствор сравнения 0,1 % раствор аммиака. Записывают спектр поглощения раствора испытуемой крови. Затем в измерительную и сравнительную кюветы добавляют по 4 мг дитионита натрия, осторожно перемешивают и снова записывают при тех же длинах волн оптические плотности.
Оценка результата. Сохранение двух максимумов при втором измерении, после добавления дитионита натрия, является качественной характеристикой наличия в исследуемой пробе карбоксигемоглобина.
Содержание карбоксигемоглобина в % вычисляется по значениям оптической плотности раствора крови после добавления дитионита натрия в максимуме при 540 нм – D1 и при 550 нм – D2. Коэффициенты К1=0.77 и К2=0.37.
(D1 – D2*К1)*100
% СОНb = -----------------------------
(D2*К2)
Примечание:
Расчет коэффициентов К1 и К2 находили по результатам 10 модельных определений. При этом образцы крови насыщают кислородом и окисью углерода. Коэффициенты рассчитывают по формуле:
К2=(D3-D0)/D2 и К1=D0/D2 ,
где: D0 – оптическая плотность обработанного дитионитом натрия раствора крови, содержащего дезоксигемоглобин и не содержащего карбоксигемоглобин при аналитической длине волны;
D2 – оптическая плотность раствора крови, обработанного дитионитом натрия при длине волны в изобестической точке;
D3 – оптическая плотность раствора крови, дополнительно насыщенного окисью углерода при выбранной «аналитической» длине волны.
Насыщение образцов крови кислородом производят, пропуская кислород через раствор крови в течение 10 минут. При этом кровь освобождается от метгемоглобина и остаточного карбоксигемоглобина.
Методика насыщения крови СО (II). Насыщенный оксидом углерода (II) раствор крови получают в специальном приборе, который состоит из колбы, закрытой пробкой, снабженной капельной воронкой и отводной стеклянной трубкой для выхода оксида углерода (II) из колбы, четырех склянок Дрекселя и отводной трубки. Колбу и склянки Дрекселя соединяют между собой резиновыми трубками. При отсутствии склянок Дрекселя их можно заменить колбами вместимостью 50 мл, отверстия которых закрыты пробками, снабженными двумя стеклянными трубками.
В первую колбу вносят 50 мл концентрированной серной кислоты, а в капельную воронку — 10 мл муравьиной кислоты. В 1-ю склянку Дрекселя вносят 10 %-й раствор гидроксида натрия, во 2-ю и 3-ю склянки — дистиллированную воду, а в 4-ю склянку — ½ часть раствора исследуемой крови в 0,1% растворе аммиака, предварительно насыщенной кислородом. В склянки вносят столько жидкости, чтобы трубки погружались на 2 см в жидкость.
Из капельной воронки в подогретую колбу / по каплям приливают муравьиную кислоту. Интенсивность выделения оксида углерода (II) регулируют скоростью приливания муравьиной кислоты. По мере расходования муравьиной кислоты выделение газа замедляется. В начале опыта для увеличения скорости выделения оксида углерода (II) колбу осторожно нагревают на небольшом пламени газовой горелки.
Учитывая высокую токсичность оксида углерода (II), при работе с ним необходимо соблюдать осторожность. Получение оксида углерода (II) и насыщение крови этим газом должно производиться в вытяжном шкафу с хорошей тягой.
Оксид углерода (II) из колбы пропускают через склянки Дрекселя в течение 15 мин. За это время оксигемоглобин крови полностью превращается в карбоксигемоглобин. Однако при этом в растворе может оставаться некоторое количество метгемоглобина, который необходимо перевести в дезоксигемоглобин, а затем в карбоксигемоглобин. С указанной целью после пятиминутного пропускания оксида углерода (II) от прибора отсоединяют склянку с раствором исследуемой крови, в которую вносят 5—7 мг дитионита натрия, и жидкость хорошо взбалтывают. (Осторожно! Не вдыхать оксид углерода (II)!). Затем склянку 4 присоединяют к прибору и в течение 5 мин пропускают оксид углерода (II). После насыщения оксидом углерода (II) раствор крови, содержащий карбоксигемоглобин, должен быть прозрачным.
Значение коэффициентов К1 и К2 рекомендуется проверять не реже 1 раза в год.
Газохроматографический метод обнаружения количественного определения карбоксигемглобина основан на определении оксида углерода (П) с помощью парофазного анализа. Обнаружение проводят непосредственно в газовой фазе или после восстановления до метана или окисления до оксида углерода (11).
1-й вариант метода. К крови добавляют карбонат или гидрокарбонат натрия. Оксид углерода (П) переходит в газовую фазу.? Ее отбирают шприцом и вводят в хроматограф. Используют детектор по теплопроводности (катарометр). Обнаружение проводят по времени удерживания. Концентрацию оксида углерода (П) рассчитывают по калибровочному графику, выражающему зависимость площади пика от концентрации оксида углерода (П). В таком варианте определение оксида углерода (П) в крови возможно при его содержании 30-100%. Ошибка метода составляет 10%.
2-й вариант метода. Выделение оксида углерода (П) из крови проводят, как и в первом варианте. Газовую фазу вводят в дозатор прибора. В качестве газа-носителя рекомендован гелий, который вытесняет СО из дозатора и переносит в хроматографическую колонку с никелевым катализатором на ИНЗ-600. Под действием водорода СО восстанавливается до метана (СН4), появление которого в системе регистрируется пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Преимущество метода в высокой чувствительности и возможности проведения анализа с малыми навесками крови (0,1 мл).
3-й вариант метода основан также на применении парофазного анализа. В парогазовой фазе содержится смесь СО и С02 эндогенного происхождения. Используется колонка с силикагелем, на которой разделяются оксид углерода(1У) и оксид углерода(11). Это разделение фиксируется детектором. Затем оксид углерода(11) в специальной ячейке окисляется оксидом йода(У) до диоксида углерода (1У), и регистрируется общее количество С02. Концентрацию оксида углерода(11) определяют по разнице полученных пиков эндогенного С02 и суммарного количества С02.
Метод микродиффузии. Описание метода и используемого прибора приведено ранее (см. раздел 6.6.2). Во внешнюю камеру прибора вносят 1 мл крови и 1 мл 10% раствора серной кислоты. Во внутреннюю камеру помещают 2 мл 0,1% раствора хлорида палладия в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты. Прибор закрывают крышкой и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. При наличии в крови оксида углерода (11) во внутренней камере появляется серебристая пленка металлического палладия.
PdCI2 + СО + Н20 -+ Pd + 2HCI + С02
Методика определения карбоксигемоглобина (ВОЗ, Женева, 1998) заключается в следующем. Для анализа исследуемую кровь делят на 3 части. Одну часть (А) оставляют без изменения, вторую часть (В) насыщают оксидом углерода до 100% содержания СОНЬ и используют в качестве стандарта, третью часть (С) насыщают кислородом до полного вытеснения СО, т.е. получают 100% оксигемоглобина.
540 нм |
579 нм |
X, нм |
Расчет содержания карбоксигемоглобина ведут по величине отношения оптической плотности А540/А579. Находят отношение А540/А579 для растворов А, В и С. Эти отношения подставляют в формулу:
Этот метод эффективен при исследовании крови, содержащей более 10% карбоксигемоглобина. Физиологическая норма содержания карбоксигемоглобина в крови составляет от 1,5 до 3,1%, для курильщиков - <10%. Смертельная концентрация карбоксигемоглобина в крови составляет в среднем - 60% и может колебаться в зависимости от внешних условий и особенностей организма от 40 до 80%.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1. Какие пути проникновения оксида углерода (II) в организм при отравлениях?
2. Что образуется при взаимодействии оксида углерода (II) с гемоглобином?
3. Что такое дезоксигемоглобин, оксигемоглобин и метгемоглобин и как они взаимодействуют с оксидом углерода (И)?
4. Какие основные симптомы отравления оксидом углерода (II)?
5. При каком содержании карбоксигемоглобина в крови человека может наступить смерть?
6. С помощью каких методов можно обнаружить карбоксигемоглобин в крови?
7. На чем основано обнаружение карбоксигемоглобина в крови при помощи качественных реакций? Почему необходимо параллельно проводить пробы с кровью, не содержащей оксида углерода (II)?
8. В чем заключается обнаружение карбоксигемоглобина методом микродиф-узии?
. Как производится количественное определение карбоксигемоглобина методом спектрофотометрии в УФ-области?
Дата добавления: 2015-01-30; просмотров: 35 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |