Студопедия  
Главная страница | Контакты | Случайная страница

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Получение протопластов

Читайте также:
  1. III. Порядок оформления требований-накладных в аптечное учреждение (организацию) на получение лекарственных средств для лечебно-профилактических учреждений
  2. А) действия, направленные на получение информации неопределенным кругом лиц или передачу информации неопределенному кругу лиц
  3. Алканы. Строение, свойства, получение и применение
  4. Билет № 54 Маркетинговая информация: получение и использование.
  5. Вопрос № 16. Ритуальные услуги. Право на получение пособия по погребению.
  6. к аппаратно-программному комплексу аудио-видеонаблюдения, используемому для приема квалификационных экзаменов на получение права на управление транспортными средствами
  7. К условиям усыновления СК РФ отнесено получение согласия определенного круга лиц
  8. НЕЗАКОННАЯ ВЫДАЧА ЛИБО ПОДДЕЛКА РЕЦЕПТОВ ИЛИ ИНЫХ ДОКУМЕНТОВ, ДАЮЩИХ ПРАВО НА ПОЛУЧЕНИЕ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ ИЛИ ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ (СТАТЬЯ 233)
  9. Параметры кривой роста микроорганизмов и получение целевого продукта
  10. Переменный ток, его получение.

Основным методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты клеток грибов в результате обработки их клеточных стенок ферментным комплексом, содержащимся в желудочном соке виноградной улитки Helix pomatia. Некоторые виды актиномицетов так же способны продуцировать ферменты лизирующие оболочки различных эукариотических клеток, в частности грибов. В микробиологических экспериментах протопласты получались путем разрушения клеточных стенок бактерий ферментом лизоцимом, выделяемым из белка куриных яиц.

Для удаления клеточной стенки при получении растительных протопластов используются ферментные препараты трех типов – целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов состоит в деструкции основных компонентов клеточной стенки, обеспечивающих ее механическую прочность (ригидность). У растительных клеток этими компонентами являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества, которые находятся в клеточной стенке в различных соотношениях.

Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время, после чего их необходимо тщательно отмыть. При этом на всех стадиях необходимо поддерживать жесткие асептические условия. Стерилизация используемых ферментных растворов производится, как правило, путем фильтрования через бактериальные фильтры. Поскольку протопластированные клетки лишены жесткой оболочки, то они становятся очень чувствительными к перепадам концентраций различных веществ внутри клетки и снаружи, в культуральной среде (осмотический шок). Поэтому для отмывки от ферментов нельзя использовать дистиллированную воду, а культивирование протопластов осуществляют на специально подобранных, так называемых гипертонических средах, содержащих различные осмотические стабилизаторы (обычно сорбитол, маннитол в концентрации примерно 125 мг/л). Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны и другие условия. Например, протопласты чаще всего получают в темноте или при слабом освещении. Температурные условия могут варьировать в пределах; 22-280С, стабильности протопластов в определенной степени способствуют высокие концентрации двухвалентных ионов кальция и магния, воздействующих на мембранные системы клетки. Значение рН среды для культивирования протопластов должно быть в проделах 5,5-5,8. Уменьшение рН среды до 3.5 приводит к быстрому (за несколько минут) разрушению и гибели протопластов большинства видов растений. Очень важной проблемой клеточной инженерии растительных организмов является регенерация протопластов. Синтез клеточной стенки у образовавшихся протопластов практически начинается сразу после удаления раствора ферментов, вызвавших ее деструкцию, что можно относительно легко наблюдать с помощью флюоресцентного микроскопа. Для предотвращения преждевременной регенерации в питательную среду вводят кумарин в концентрации 200-250 мг/л.

Некоторые изолированные протопласты за тот короткий промежуток времени, пока они не образуют клеточную стенку, могут сливаться друг с другом, т.е. ведут себя подобно половым клеткам. Такое слияние является спонтанным и происходит чаще, если используются протопласты, полученные из молодых тканей или из суспензионных культур клеток. Однако этот процесс может быть стимулирован путем добавления определенных веществ, что позволяет осуществить слияние не только протопластов одного вида, но и гетерологичных (парасексуальная гибридизация). Довольно эффективным индуцирующим слияние протопластов агентом оказался полиэтиленгликоль (ПЭГ), обеспечивающий сильную адгезию протопластов. С его помощью были получены гибриды протопластов растений и животных клеток, протопласты растений и водорослей. Недостатком данной техники является то, что с ее помощью не удается получить большое количество слившихся протопластов за один прием. Другим способом стимулирования слияния является электропорация – кратковременная обработка культуры протопластов электрическими импульсами высокого напряжения. При всех методах на первом этапе происходит агрегация протопластов вследствие, как полагают, изменений их поверхностного потенциала. Последующее воздействие индукторов слияния сводится к определенным изменениям структуры мембран, увеличивающим их слипаемость и текучесть. Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, возникает, вероятнее всего, в результате диэлектрического разрушения (пробоя) соприкасающихся участков мембран протопластов. Вокруг возникающей «дырки» возможен обмен молекулами липидов с образованием липидных мостиков, что, в конечном счете, приводит к слиянию мембран, поскольку возникает энергетически более выгодное состояние, нежели при наличии двух поврежденных мембран.

Разработка методов индуцированного слияния протопластов, а также развитие техники культивировании растительных клеток in vitro, обеспечивающей возможность получения изолированных протопластов, их выращивания с образованием каллуса и в последующем целого растения, обеспечила формирование нового весьма перспективного метода гибридизации растений, получившего название соматической (парасексуальной) гибридизации. Сущность данного приема состоит в том, что в качестве гибридизуемых клеток используют не гаметы (репродукционные клетки), а соматические клетки растений, из которых получаются протопласты. В этом случае становится возможным слияние протопластов полученных даже из разных организмов (межвидовое, межродовое скрещивание). Слияние протопластов обеспечивает объединение не только клеточных геномов, но и двух различных цитоплазм. В большинстве описанных (известных) случаев слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного.

 




Дата добавления: 2015-01-30; просмотров: 40 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав

1 | 2 | 3 | <== 4 ==> |


lektsii.net - Лекции.Нет - 2014-2024 год. (0.007 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав