Читайте также:
|
4. Очистка продукта. Очистку продуктов микробного биосинтеза проводят когда получают продукцию с большим количеством примесей. Хроматография – процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, но не одно, а несколько, часто близких по структуре. Диализ – процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут переходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Кристаллизация. Этот процесс базируется на различной растворимости веществ при разных температурах.
16.Методы концентрирования и обезвоживания продуктов микробного синтеза. Концентрирование продукта проводят методами обратного осмоса, ультрафильтрации, выпаривания.
Если мембрана пропускает воду, задерживая растворенные в ней вещества, речь идет об осмосе. Прямой осмос - диффузия вещества через мембрану, разделяющую раствор и растворитель. Раствор помещают в мешок из полупроницаемого материала, а мешок погружают в сосуд с растворителем. За счет разности давлений и осмоса происходит концентрирование продукта. Растворитель, поступающий извне, оказывает на мешок давление, называемое осмотическим. Если к раствору приложить внешнее давление, превышающее осмотическое, то растворитель вытекает через полупроницаемую мембрану против градиента концентрации растворенного вещества, т.е. происходит дальнейшее концентрирование раствора. Подобный процесс представляет собой обратный осмос, используемый как метод концентрирования продукта.
Ультрафильтрация - отделение веществ с помощью мембранных фильтров. Некоторые марки фильтров предназначены для отделения лишь сравнительно крупных частиц: иммуноглобулинов, коллоидных агрегатов, вирусов. Мембраны с наиболее мелкими порами задерживают молекулы органических кислот. Ультрафильтрация протекает при умеренно высоком давлении (20-400 кПа), приложенном к жидкости. Применяется для концентрирования таких малостабильных продуктов, как молочная и глютаминовая кислоты, некоторые антибиотики и ферменты.
Наиболее древний метод - выпаривание. Его недостаток состоит в необходимости нагревания, которое проводят при низком давлении. Используют вакуум-выпарные аппараты. Нагревающим агентом чаще всего служит водяной пар, хотя используют также обогрев жидким теплоносителем или электрообогрев. Пар характеризуется большой теплотой конденсации и облегчает регулировку процесса выпаривания.
Обезвоживание продукта - сушка на подносах, на ленточном конвейере с подогревом, подачей газообразного нагревательного агента (воздух, СО2, дымовые или топочные газы и др.) в сушильный аппарат, в вакуум - сушильных шкафах, в барабанных и распылительных сушилках.
При сушке в кипящем слое газообразный нагревательный агент мощной струей врывается в сушильный аппарат снизу и частицы обезвоживаемого продукта парят в газовом потоке.
Особо чувствительные к нагреву материалы сушат в вакуум-сушильных шкафах, при пониженном давлении и температуре.
Барабанные сушилки, в которых обезвоживают микробные суспензии, состоят из вращающихся подогреваемых барабанов, погруженных в сосуд с суспензией. Соприкасаясь с барабаном, суспензия обезвоживается и присыхает в виде пленки к его стенкам. Высохшую биомассу соскребают со стенок ножом.
17.Методы модификации и стабилизации продуктов микробиологического синтеза. Модификация продукта - перестройка полученных соединений животного, растительного или микробного происхождения с целью придания им специфических свойств, необходимых человеку. Химическая модификации необходима в тех случаях, когда биотехнологический процесс дает лишь «заготовку» целевого продукта. Например, пенициллин G, образуемый Penicillum notatum, модифицируют с целью получения ампициллина, метициллини и др. полусинтетических пенициллинов. К синтезированной организмом структуре химическим путем присоединяют необходимые заместители. Важный момент - придание продукту оптической асимметрии. Биообъект (например, дрожжи) избирательно потребляют один из изомеров (например, L-аминокислоты), в среде остается его оптический антипод. Подобная технология известна со времен Луи Пастера.
Модификация - необходимый этап в получении ряда ферментов, гормонов, препаратов медицинского назначения. Например, у бычьего инсулина «отстригают» аминокислотные остатки, после чего он становится идентичным человеческому гормону.
Стабилизация продукта направлена на сохранение свойств продукта в период его хранения и использования потребителем (добавление наполнителей, модификация и др.). Включает физико-химические воздействия на продукт. Сушка повышает устойчивость продукта к внешним воздействиям. Обезвоживание ферментов вызывает их устойчивость к нагреванию.
К стабилизации продуктов, в том числе кормового микробного белка, ведет добавление наполнителей из грибного мицелия, пшеничных отрубей, кукурузной муки, которые сами обладают питательной ценностью. Стабилизация ферментов достигается добавлением глицерина, углеводов или неорганических ионов - Со2+, Мg2+; Na+ для пектиназы, формалина 0,2 %-ного раствора для глюкоамилазы, антибиотиков - лизина для глюкоамилазы.
Иногда стабилизация продукта представляет собой задачу особого био-технологического процесса. Меланж, получаемый из яичных белков, - ценный пищевой продукт, через несколько месяцев хранения - темнеет, его органолептические свойства ухудшаются. Порча меланжа может быть предотвращено, если из него удалить углеводы. С этой целью на меланже рекомендуется выращивать пропионовые бактерии, «выедающие» углеводы. Это приводит к удлинению срока хранения меланжа, повышается питательная ценность, т.к. пропионовые бактерии обогащают его органическими кислотами и витамином В12.
18.Строение ферментов. Ферменты (энзимы) – катализаторы белковой природы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. Ферменты представляют собой полипептидную цепь - «скелет», в которой имеются дисульфидные мостики, придающие особую прочность пространственной структуре молекулы фермента. В ней имеются также непрочные водородные мостики между соседними атомами кислорода и водорода различных аминокислот. Молекулы ферментов небольшие, плотно «уложены», содержат всего лишь 20-30 % воды. Полярные группы аминокислот находятся в основном на поверхности фермента, что обеспечивает его хорошую растворимость а воде. На одном из участков поверхности фермента сосредоточены неполярные аминокислотные группы. Эти группы образуют активный центр фермента. В контакт с субстратом вступает только активный центр фермента, обычно состоящий из 3-12 аминокислотных остатков (рис. 6).
Основная функция остальных аминокислот состоит в придании ферменту специфической формы (поддержании глобулярной четвертичной структуры), от которой зависит эффективность работы активного центра фермента.
19.Специфичность и неспецифичность действия ферментов. Ферменты очень специфичны. Фишер в 1890 году высказал гипотезу «ключа и замка», в которой он объяснил такую специфичность точным соответствием формы субстрата форме активного центра фермента, как ключ соответствует замку. Образованные в результате ферментации продукты отделяются от активного центра фермента поступают в окружающую среду, после чего фермент может вновь вступает в реакцию с субстратом.
В 1959 году Кошланд сформулировал гипотезу «индуцированного соответствия», согласно которой молекула субстрата, взаимодействуя с ферментом, вызывает изменения в его структуре. Поэтому аминокислоты активного центра фермента принимают определенную форму, позволяющую ферменту наиболее эффективно выполнять свою функцию. В белковой части молекулы фермента может находиться и аллостерический центр, который влияет на его активность. Если при присоединении к аллостерическому центру вещество увеличило активность фермента, его называют позитивным эффектором, а если снизило - негативным эффектором. Многие ферменты содержат небелковую часть, называемую кофактором. Кофакторы делят на три группы: неорганические ионы, простетические группы (флавинадениндинуклеотид (ФАД), биотин гемм и др.) и коферменты (никотинамидадениндинуклеотид (НАД), НАДФ, АТФ и др.). По выполняемым функциям кофакторы делят на 3 вида:
1. участвуют в переносе водорода или электронов - участвуют в окислительно-восстановительных реакциях;
2. участвуют в переносе групп атомов;
3. катализирую синтез и распад углеродных связей.
20.Классификация ферментов. 1. Оксидоредуктазы. Они катализируют окислительно-восстановительные реакции переноса атомов водорода и кислорода от одного вещества к другому (каталаза, дегидрогеназа, оксидаза и др.).
2. Трнсферазы. Катализируют перенос различных групп атомов (ацильной, метильной, фосфатной или аминогрупп) от вещества к веществу (протеинкеназа, пируваткеназы и др.).
3. Гидролазы. Катализируют реакции гидролиза, протекающие с расщеплением внутримолекулярных связей и присоединением воды в точке расщепления (амилаза, липаза, пептидаза и др.).
4. Лиазы. Катализируют реакции отщепление и присоединение групп атомов с образованием двойной связи (фумараза, альдолаза, аспартаза).
5. Изомеразы. Катализируют реакции внутримолекулярной перестройки (изомераза, глюкозоимераза и др.).
6. Лигазы. Катализируют соединение молекул с образованием новых связей с использованием связей молекул АТФ (ДНК-лигаза, синтетаза).
Ферменты синтезируются, как все белки, на рибосомах и накапливаются в цитоплазме и др. структурах, находятся на поверхности клетки, или выделяются в окружающую среду.
21.Принцип действия простых и сложных ферментов. Механизм действия ферментов состоит в снижении энергии активации, необходимой молекуле субстрата, чтобы вступить в реакцию. Согласно существующим теориям (промежуточных соединений, адсорбционной, цепных реакций) снижение энергии активации происходит в результате адсорбции реагирующих веществ на поверхности фермента с образованием промежуточного нестойкого соединения – фермент-субстратного комплекса, что приводит реагирующие вещества в напряженное состояние и способствует быстрому протеканию реакции. Фермент является начальным, или «запальным» фактором, в дальнейшем катализируемая им реакция протекает самостоятельно. Поэтому основная роль биокатализатора состоит в преодолении молекулами субстратов активационного барьера на более низком энергетическом уровне. Кроме того, в активном центре сосредоточено много неполярных групп, и эта область действует как органический растворитель. Здесь же находится небольшое число заряженных полярных боковых групп аминокислот, реакционная способность которых выше в органическом растворителе, чем в водной среде. Имея большую гибкую молекулу, ферменты способны сосредоточить на небольшом участке необходимые группы для осуществления конкретной реакции с субстратом.
У сложных ферментов, имеющих кофакторы, возможности взаимодействия с субстратом значительно увеличиваются. Соединение фермента с субстратом в каталитическом центре может происходить с помощью ковалентных связей, при участии электронов, с помощью водородных связей или более слабых взаимодействий, например сил Ван-дер-Ваальса. Причем фермент и субстрат в районе активного каталитического центра должны сблизиться до расстояния 1,5-2 нм. В этих условиях внутренние связи в молекуле субстрата ослабляются, и создается возможность для реакции с ферментом.
В водном растворе вещества реагируют только при столкновении. Если бы не было ферментов, эти столкновения были бы крайне редки. Как известно, ферменты обладают очень высокой каталитической активностью. Одна молекула фермента за 1 мин может прореагировать с тысячами и даже миллионами молекул специфического субстрата. Так, алкогольдегидрогеназа, катализирующая превращение ацетальдегида в этиловый спирт, превращает в 1 мин 4700 молекул субстрата, а фосфотриозоизомераза -500 тыс. молекул.
Для действия каждого фермента характерна оптимальная температура, при которой скорость реакции максимальна. Так, α-амилаза культуры Aspergillus oryzae имеет оптимум температуры 50-55°С. Оптимум температуры большинства используемых в биотехнологии ферментов микроорганизмов 30-40 °С. Оптимум действия одних ферментов, например пепсина, наблюдается в кислой среде (рН 2,0), других - в щелочной, а у большинства ферментов - в нейтральной.
Активаторами многих ферментов являются цистеин и глутатион. Эти вещества восстанавливают дисульфидную связь, образуя SH-группы, которые входят в состав каталитических центров и часто определяют ферментативную активность. Ингибиторы ферментов могут быть неспецифическими (например, соли тяжелых металлов, которые при связывании с белками осаждают их из растворов) или специфическими (например, синильная кислота, которая реагирует с определенными химическими группами ферментов и ингибирует железосодержащих дыхательных ферментов).
22.Ферменты из растительного сырья. В промышленных условиях ферменты из растений получают в суб-тропических и тропических странах. Для этого используют такие растения, как папайя, ананас и инжир. Плоды папайи в стадии молочной зрелости содержат в соке значительное количество протеолитических ферментов. В этот период собирают сок плодов папайи. Для этого острым ножом сверху вниз слегка надсекают плоды, которые на деревьях образуют грозди. Плоды остаются на деревьях, а под гроздь подвешивают ведро, в которое стекает сок в течение суток или нескольких часов. Затем сок, который чаще называют латексом, тонким (1-1,5 см) слоем разливают в плоские емкости и ставят в теплое место, в солнечный день обычно в тени. Латекс быстро высыхает, образуя тонкие пластины, которые легко снимаются. Их можно измельчить для получения технического препарата - папаина, а можно сразу подвергнуть очистке всеми известными методами: осаждением органическими растворителями, высаливанием, концентрацией с помощью ультрафильтрации. Можно также использовать современные тонкие методы очистки, т. е. использовать общепринятые способы получения высокоочищенных препаратов вплоть до кристаллических и гомогенных ферментов. Вторым по объему производства протеолитическим ферментом растительного происхождения является бромелаин (бромелин). Его получают из листьев, стеблей и оболочек плодов ананаса. После уборки урожая всю зеленую массу, за исключением корневой части растения, измельчают и подвергают водной экстракции. Затем полученный экстракт обрабатывают в зависимости от дальнейшего применения. Третьим известным препаратом растительной протеиназы является фермент фицин, который получают из листьев и молодых побегов инжирного дерева. Особенность получения препарата заключается в том, что сырье собирают вручную ранним утром на восходе солнца в деревянную тару. Затем материал давят в любых емкостях, приспособленных для сбора и хранения, исключая контакт с металлом, и экстрагируют водой. Экстракт концентрируют. Жидкий концентрат можно использовать для смягчения мяса непосредственно перед кулинарной обработкой, при производстве специальных колбас и копченых мясных изделий. В умеренном климатическом поясе растительные амилолетические ферменты для пищевой промышленности получают из проросшего зерна - солода. Солод используют либо сырым в размолотом виде, либо в сухом виде. В промышленных масштабах очищенные ферментные препараты из солодов не производят.
23.Ферменты из животного сырья. В промышленных условиях при переработке мяса различных животных в самый первый момент разделки туши производят сбор ферментного сырья (поджелудочная железа, слюнные железы, слизистая оболочка желудков и тонкого кишечника, сычуги крупного рогатого скота и овец, семенники половозрелых животных).
Слизистая оболочка желудков свиней и крупного рогатого скота содержит пепсин и липазу, слюнные железы - амилазу, сычуг молодняка - сычужный фермент и т. д.
Свежеотобранные органы и ткани животных, содержащие ферменты, очень нестойки при хранении. Поэтому после сбора сырье следует немедленно переработать или законсервировать с помощью низких температур, обработки поваренной солью, ацетоном, этиловым спиртом или же высушиванием.
Для получения технических препаратов допускается консервирование животного сырья поваренной солью. Этот метод используется, например, при получении панкреатина.
Из заготовленного на мясокомбинатах животного сырья на специальных заводах органопрепаратов получают ферментные препараты различной степени очистки. Процесс получения их складывается из ряда последовательных операций: измельчение сырья, экстракция ферментов, высаливание, отделение белковых осадков от жидкой фазы, очистка, кристаллизация и сушка препаратов.
В зависимости от вида используемого сырья применяют различные методы измельчения и разрушения клеток. К ним относят: попеременное замораживание и оттаивание, автолиз, обработку дубильными веществами, органическими растворителями и др. Клеточные оболочки и ткани, содержащие большое количество влаги, можно разрушить механическим измельчением и прессованием.
В настоящее время используют механическое измельчение сырья на специальных мясорубках, волчках, куттерах и машинах, на которых можно получить тончайшие срезы с замороженного сырья (микротомы).
При измельчении животного сырья не обязательно стремиться к очень тонкому помолу, так как это может значительно затруднить дальнейшую переработку сырья. Тонкое измельчение может привести к образованию устойчивых суспензий за счет стабилизации их высокомолекулярных соединений, содержание которых в растворе резко возрастает по мере увеличения степени измельчения сырья.
Извлечение ферментов из измельченной животной ткани можно проводить тремя видами экстрагентов: водным раствором кислот при рН 1,0-2,0; водой или водными растворами солей при рН 7,0-8,0; концентрированным водным раствором органических растворителей (этанол, метанол, ацетон, глицерин).
Экстракцию проводят ступенчато, 2-3 раза заливая обрабатываемое сырье экстрагентом. Для лучшего извлечения ферментов всю массу в процессе экстракции перемешивают. После каждого настаивания обрабатываемого сырья экстрагент отделяют центрифугированием. Если выделяемый фермент очень нестабилен, то вместо центрифугирования используют фильтрацию под вакуумом.
Методы выделения и очистки ферментов и экстрактов животных тканей незначительно отличаются от получения ферментных препаратов из культур микроорганизмов. Их выделяют осаждением органическими растворителями (этанол, метанол, изопропанол, ацетон, хлороформ и др.), солями (сульфат аммония, натрия или магния, ацетат натрия, хлорид натрия). В дальнейшем для более полной очистки используют диализ, ультрафильтрацию, адсорбцию.
24.Ферменты микробиологического происхождения. В связи с увеличивающимися потребностями в ферментных препаратах растительное и животное сырье не устраивает производителей. Содержание ферментов в растениях, как правило, низкое. Кроме того, получение ферментов из растений носит сезонный характер. Органы животных также можно получить только на мясокомбинатах, при этом возникают проблемы с консервированием и хранением этого вида сырья.
Единственным неограниченным источником ферментов являются микроорганизмы, из которых можно выделить любые из известных в настоящее время ферментов, за исключением папаина.
Синтезируемые микроорганизмами ферменты подразделяют на внеклеточные и внутриклеточные. К внеклеточным относят амилазу, целюлазу, лактазу, липазу, пектиназу, протеазу, к внутриклеточным – аспарагиназу, каталазу, инвертазу.
Внеклеточные ферменты получают из культуральной жидкости, предварительно отделенной от микроорганизмов. Для выделения внутриклеточных ферментов разрушают клеточные оболочки физическими или химико-ферментативными методами (гидролиз, ферментолиз, автолиз и др.). Далее выделение ферментов внутриклеточного и внеклеточного происхождения идет по одинаковой схеме. Вначале ферменты выделяют методами экстракции, осаждения, адсорбции, ионного обмена, ультрафильтрации и др., а затем очищают при помощи хроматографии, диализа и кристаллизации. При необходимости ферменты концентрируют, обезвоживают, модифицируют и стабилизируют.
Современные методы генетики и генетической инженерии позволяют целенаправленно увеличивать выход необходимого фермента. Кроме того, среди микроорганизмов можно найти формы, живущие в экстремальных условиях (термофилы, галофилы и др.). Это означает, что из микроорганизмов можно выделить ферменты с улучшенными свойствами - термостабильные, осмоустойчивые, кислото- и щелочеустойчивые.
25.Способы иммобилизации ферментов. Иммобилизация - это прикрепление фермента к нерастворимому носителю, причем таким образом, чтобы фермент мог обмениваться с раствором молекулами субстрата и продукта. Методы иммобилизации ферментов
1. Адсорбция на носителе (рис. 10.А). Носителями могут быть неорганические материалы (стекло, силикагель, бентонит, оксид алюминия, диоксид титана и др.), природные полимеры (целлюлоза, коллаген) и синтетические полимеры (нейлон, полиэтилен, полипропилен).
2. Включение в гель агар-агара, альгинатов, карагинана
Молекулы фермента сидят в порах геля. Гель проницаем для молекул субстрата и продуктов реакции за счет молекулярной диффузии.
3. Ковалентное связывание с носителем. Носителем в этом случае является полимерный материал, длинные молекулы которого в разных местах связаны химическими ковалентными связями с молекулами фермента (рис. 11.А).
4. Поперечная «сшивка» молекул фермента при помощи бифункциональных реагентов. Молекулы фермента, свободно перемещающиеся в растворе, соединяются между собой различными своими участками с помощью определенных реагентов. Получается некое пространственное образование, включающее активные молекулы фермента и довольно большие пространства между ними, удобные для диффузии молекул субстрата и продукта реакции.
5. Адсорбция на носителе с последующей поперечной «сшивкой». Этот способ сочетает в себе способы 1 и 4.
По сравнению с обычной адсорбцией на носителе получается более глубокий слой молекул фермента, доступных для субстрата и продукта, а по сравнению с обычной «сшивкой» - более прочная гранула, имеющая жесткий остов в центре.
6. Включение в полупроницаемые капсулы. Внутри капсулы (рис. 12.Б) как бы существует коллоидный раствор фермента. Внешняя оболочка капсулы довольно прочная, непроницаема для фермента, но проницаема для продукта и субстрата.
7. Сополимеризация фермента и полимера-носителя. Напоминает включение в гель, но матрица создается путем сополимеризации полифункционального реагента и фермента (т.е. фермент не просто находится в «клетке» геля, но и сцеплен с ней). Этот способ является сочетанием способов 2 и 4.
8. Физическое смешение - перемешивание фермента и порошка носителя. Метод довольно прост, но не очень надежен. Фермент может отслаиваться от носители и переходить в раствор.
Во всех случаях иммобилизации допускается прикрепление фермента только с помощью функциональных групп, не входящих в активный центр фермента. Один и тот же фермент может быть иммобилизирован несколькими методами. Однако иммобилизация всегда связана с потерей части активности фермента, кроме того, частично нарушается свободный доступ фермента при его связывании. Но, несмотря на потерю от 10 до 90 % активности фермента при его иммобилизации и на уменьшение скорости течения реакции такие ферменты имеют технологические преимущества по сравнению с несвязанными. Их можно легко отделить от продуктов реакции и использовать многократно и фермент не загрязняет продукт. Кроме того, иммобилизованные ферменты более стабильны к действию температуры и рН среды. Так ферменты, которые в свободной форме инактивируются при 50 ºС мгновенно, после иммобилизации работают неделями и
Дата добавления: 2015-04-20; просмотров: 53 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |