В аэробных условиях. Бактерии рода Aspergillus.
Лимонная кислота- одно из немногих так широко исп. В промышленности. Исп. В изготовлении напитков также в пищевой, фармацевтической промышленности.
32.Понятие «генетическая» инженерия и ее уровни. «Генная инженерия - это управление генетической основой организмов посредством внедрения или удаления специфических генов, с использованием техники современной молекулярной биологии». Уровни генетической инженерии:
1. генная - прямое манипулирование рекомбинантными ДНК, включающими отдельные гены;
2. хромосомная - манипулирование с группами генов или отдельными хромосомами;
3. геномная (клеточная) - перенос всего или большей части генетического материала от одной клетки к другой (клеточная инженерия).
33. Ферменты генетической инженерии. Ферменты генетической инженерии - это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности и т. д.
Среди ферментов ГИ выделяют:
ДНК-полимеразы. Чаще всего в ГИ используют фермент ДНК-полимеразу I, выделенную из Esherichia coli (кишечной палочки) или фага Т4. ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять цепь ДНК путем присоединения комплиментарного нуклеотида. Это свойство фермента используется в ГИ для построения второй комплиментарной цепи ДНК, т е по сути - это удвоение ДНК.
Из некоторых вирусов выделена специфическая ДНК-полимераза - РНК-зависимая, названная ревертазой, с помощью ривертаз получают молекулы ДНК и РНК.
ДНК-лигаза - осуществляет одну функцию - соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот процесс назван лигированием. В ГИ для лигирования обычно используют ДНК-лигазу фага Т4.
Нуклеазы - это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот, в результате чего молекулы ДНК и РНК распадаются на фрагменты или отдельные нуклеотиды.
Нуклеазы по типу их действия делят на группы:
1. нуклеазы, действующие только на ДНК или РНК;
2. нуклеазы, действующие и на ДНК и на РНК одновременно (нуклеаза золотистой фасоли).
34.Классификация рестриктазы,используемых в генетической теории. Рестриктазы - специфическая группа нуклеаз. В ГИ используется около 200 видов рестриктаз. Эти ферменты способны гидролизовать ДНК строго по определенным специфическим последовательностям - сайтам рестрикации. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикации и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикации, либо в непосредственной близости от него. По характеру расщепления рестриктазы делят на несколько типов:
- рестриктазы I типа узнают сайт рестрикации, но расщепляют последовательность нуклеотидов ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов). Такие рестриктазы в ГИ используют редко;
- рестриктазы III типа - похожи на рестриктазы I типа, они гидролизуют ДНК на расстоянии 20-35 нуклеотидных последовательностей от сайта узнавания и тоже используются в ГИ довольно редко;
- рестриктазы II типа - чаще всего используются в ГИ, у таких рестриктаз места рестрикации и сайты узнавания совпадают.
Рестриктазы II типа в зависимости от размера сайта и длинны получаемых фрагментов делят на 3 класса:
1. мелкощепящие - сайт рестрикации представлен 4 парами нуклеотидов;
2. среднещепящие - сайт рестрикации - 6-8 н.п.;
3. крупнощепящие - сайт рестрикации - 10-14 н.п.
Кроме того, некоторые рестриктазы II типа расщепляют молекулу ДНК симметрично, образуя так называемые «тупые» концы», другие - со сдвигом, с образованием «ступеньки», образуют так называемые «липкие» концы.
Фермент(рестриктаза)
-АТГЦААТТЦАТЦ- разрыв по оси симметрии
-ТАЦГТТААГТАГ-
Фермент(рестриктаза)
-АТГЦААТТЦАТЦ- разрыв со сдвигом
-ТАЦГТТААГТАГ-
Фрагменты ДНК, имеющие комплиментарные «липкие» концы могут соединяться с помощью ДНК-лигаз и сайт рестрикации восстанавливается.
35.Источники получения генов в генной инженерии. Существует 3 основных способа получения генов в ГИ:
1. Получение гена при помощи химико-ферментативного синтеза. Этот метод используют если известна первичная структура того белка, который кодируется данным геном.
2. Получение генов из природного источника. Из природной ДНК с помощью соответствующих ферментов (рестрикционных эндонуклеаз) «вырезают» нужный ген.
В таком способе выделения генов есть существенные недостатки:
• очень трудно подобрать ферменты чтобы точно «вырезать» нужный ген. Обычно вместе с геном остаются по бокам «лишние» нуклеотиды, что мешает дальнейшему использованию гена, или наоборот, ферменты отрезают часть гена, делая его функционально неполноценным.
• гены эукариот имеют сложное мозаичное строение, что мешает их нормальному функционированию при последующем их размножении в микроорганизмах.
• если ген составляет незначительную долю от всей молекулы ДНК (из которой его выделяют), то возникают трудности с его изоляцией и идентификацией.
3. Самый распространенный способ получения генов - это получение генов посредством ферментативного синтеза. При этом сначала из клеток выделяют матричные (информационные) РНК (мРНК), среди которых присутствует и мРНК, кодируемая геном, который нужно выделить. Затем в специально подобранных условиях осуществляют РНК-направленный синтез ДНК, катализируемый ферментом обратной транскриптазой (ревертазой). Новая цепь ДНК образуется (из дезоксирибонуклеозидтрифосфата) в присутствии ионов Mg2+. Успех синтеза зависит от наличия примесей в выделенной молекуле РНК и примесей в ферменте (ревертазе). После синтеза ДНК, ее очищают и синтезируют на ее основе еще одну ДНК. Реакцию катализируют ревертазой или ДНК-полимеразой. Таким образом, получают нужный для дальнейшего использования ген.
36.Конструирование рекомбинантной ДНК. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных био-логических источников. Соединение фрагментов ДНК в единую молекулу производится несколькими методами, в зависящими от того, какие концы фрагменты сшиваемых ДНК.
Соединение фрагментов по одноименным «липким» концам. Некоторые рестриктазы разрывают молекулу ДНК, образуя симметричные ступеньки, разрыв находится на одинаковом расстоянии центра от сайта узнавания. Эти комплиментарные друг другу участки могут соединяться за счет спаривания комплиментарных оснований. Но любые два фрагмента независимо от происхождения, образовавшиеся под действием одной рестриктазы могут «слипаться» за счет образования водородных связей между комплиментарными основаниями. Однако после такого соединения целостность двойной спирали не восстанавливается, поскольку остается два разрыва в фосфодиэфирном остове. Полная целостность спирали восстанавливается только при действии ферментов ДНК-лигаз, т.е. ДНК-лигазы завершают образование рекомбинантной ДНК
Соединение фрагментов по «тупым» концам. «Тупые» концы фрагментов ДНК, полученные после действия рестриктаз соединяются также за счет ДНК-лигаз. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке «липкими» концами. Однако «липкие» концы можно ферментативным путем присоединить к «тупым». Для этого используют фермент – концевую трансферазу из тимуса теленка. Процесс сшивки завершается действием ДНК-лигазы.
Соединение фрагментов с разноименными липкими концами.
В ситуации, когда необходимо соединить фрагменты ДНК, имеющие некомплиментарные нуклеотиды, применяют так называемые линкеры (или «переходники». Линкеры – это химически синтезируемые олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикации или их комбинации. Существуют линкеры «тупой конец – липкий конец». При необходимости липкие концы можно «затупить». Это достигается отщеплением нуклеотидов «липких» концов с помощью нуклеаз, либо «липкие» концы «застраивают», т.е. с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых «липких» концах синтезируют вторую нить. Таким образом, из фрагмента ДНК с «липкими» концами получается фрагмент с «тупыми», и он соединяется с другим фрагментом ДНК с «тупыми» концами ДНК-лигазой. После соединения фрагментов рекомбинатной ДНК, ее нужно ввести в живую клетку. Делают это при помощи так называемых векторов.
37.Векторы генетической инженерии, классификация и требования к ним. Вектор - саморегулирующаяся (автономная) молекула ДНК, используемая в ГИ для переноса генов и др. последовательностей от организма донора в организм-реципиента, а также для клонирования последовательностей нуклеотидов.
Благодаря молекулам векторов стало возможным введение в живую клетку рекомбинантной ДНК. Дело в том, что при обычном введении ДНК, например, в бактериальную клетку, она, как правило, атакуется ферментами, которые гидролизуют ее до нуклеотидов. Иногда ДНК «выживает», но при делении клеток такая ДНК не наследуется и теряется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала частью генетического аппарата клетки, она должна встроиться в геном клетки и реплицироваться в ней.
В качестве векторов используют плазмиды, бактериофаги, вирусы животных и др. Первые векторы - плазмиды были выделены из бактерий. В последующем большинство векторов конструировались методами ГИ.
Векторы бывают следующих типов:
1. Векторы для клонирования - используют для увеличения (амплификации) фрагмента ДНК, встроенного в такой вектор посредством репликации. К таким векторам относят бактериальные плазмиды и фаги, для клонирования больших участков используют искусственные бактериальные и дрожжевые хромосомы.
2. Экспрессионные векторы. Их используют для анализа последовательностей генов и их белковых продуктов, так как в данных векторных молекулах гены имеют внешнее фенотипическое проявление. Таких векторов огромное множество, они есть в клетках дрожжей, растений и млекопитающих. В эукариотических клетках такие векторы всегда содержат экспрессионную кассету.
3. Векторы для трансформации. Их используют для введения чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента.
Современные векторы обычно полифункциональны, т.е. совмещают в себе несколько функций.
Обычно в состав вектора входит маркерный ген, который проникая в клетку, придает ей специфический фенотип, свидетельствующий о присутствии определенного вектора. Часто в качестве маркерных используют гены устойчивые к антибиотикам. Белок этих генов, как правило, может дезактивировать действие антибиотика.
Требования к векторной молекуле:
1. Вектор должен содержать уникальный сайт рестрикации для нескольких рестриктаз, что позволит встроить в него фрагмент чужеродной ДНК;
2. Вектор должен иметь определенную емкость и не абортировать встроенный фрагмент;
3. Вектор должен реплицироваться в определенных клетках за счет имеющейся точки начала репликации (ориджина);
4. Вектор должен содержать маркерный ген, облегчающий селекцию клеток, несущих ген.
Дата добавления: 2015-04-20; просмотров: 27 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |