Читайте также:
|
Основными методами генетического обследования человека являются:
· Клинико-генеалогический;
· Цитогенетический;
· Молекулярно-генетический;
· Биохимические;
· Дерматоглифический;
· Микробиологические;
· Инструментальные;
· Популяционно-статистические;
· Близнецовые.
Клинико-генеалогический метод является главным в медицинской генетике. Большинство диагнозов наследственной патологии можно установить с помощью этого метода анализа. Он требует полного и внимательного обследования больного, целенаправленного сбора анамнеза (о репродуктивной функции и наличии аналогичных поражений среди членов ядерной семьи в ряду поколений по материнской и отцовской линиям), а также клинического обследования и интервьюирования всех возможных родственников этого пробанда.
Родословная изучается по вертикали (от поколения к поколению) и по горизонтали (в пределах одного поколения). На основе медицинского заключения вырисовывается фенотип пробанда по особой схеме, которая отличается от записи в истории болезни, сделанной врачом не генетиком. Описание фенотипа начинается с оценки поведения, физического развития (рост, масса тела), контактности больного, его психического состояния и умственного развития в зависимости от возраста. Затем врач обращает внимание и отмечает особенности внешности пробанда: форма черепа, рост волос, его структура и размещение; форма и расположение ушных раковин (насечки на мочке уха), бровей, глазных щелей и расстояние между ними. Необходимо описать форму лба, носа, ротовой полости, губ, языка, нижней и верхней челюсти; наличие, количество, особенности формы и роста зубов; твердое небо, расщелина губы и/или неба; форму и размеры шеи, грудной клетки, позвоночника. Необходимо также детально обследовать верхние и нижние конечности, описать их форму, количество пальцев, дерматоглифические особенности (рисунки) ладоней и подошв, позиции ладони, подошв.
Поэтому внимание врача уделяется состоянию кожи, отмечается ее эластичность (или наоборот), рост волос, влажность, пигментация, наличие атипичных складок высыпания.
Все отмеченные симптомы соответственно записывается специальными терминами, например: акроцефалия (крутая голова, напоминающая башню), алопеция (отсутствие волос, облысение), ангиоматоз (патологическое состояние сосудов с формированием ангиом), аниридия (отсутствие радужной оболочки), аплазия (врожденное отсутствие органа), брахицефалия (увеличение поперечного размера головы), гипертелоризм (аномальное расстояние между парными органами – глазами, грудными сосками), диастема (широкое расстояние между передними зубами), макросомия (гигантизм), микрогнатия (недоразвитие верхней челюсти), микроцефалия (аномальное уменьшение головы), полифагия (повышенный аппетит). Возможность установить точный диагноз в большей степени зависит от того, насколько полно выявлены микроаномалии развития, на которые врачи, как правило, не обращают надлежащего внимания.
Исследования состояния внутренних органов традиционными методами пальпации, перкуссии и аускультации завершают клиническое обследование больного. При сборе анамнеза принципиальное значение имеют сведения о течении беременности, срок родов, масса и длина ребенка при рождении, акушерско-гинекологический анамнез матери и семьи.
Опрос и клиническое обследование как можно большего количества родственников пробанда имеет целью выявление носителей патологических генов как рецессивных, так и доминантных, а также сцепленных с полом. Рецессивные аллели клинически проявляются только в гомозиготном состоянии (имеет значение кровное родство родителей), доминантные – как в гомозиготном, так и в гетерозиготном наборе.
Следует помнить о том, что наличие и степень выраженности клинической симптоматики зависит от пенетрантности и экспрессивности определенного гена.
Пенетрантность – частота или вероятность проявления любого доминантного гена, она обозначается процентным отношением количества лиц, у которых ген проявляется в фенотипе, ко всем носителям этого гена. Экспрессивность – степень фенотипического проявления гена, мера силы гена, который определяется степенью развития признака.
В медицинской генетике термин экспрессивность используется относительно полноты выявления синдрома, а не только определенного симптома, потому что, именно синдром, а не симптом является последствием одной мутации (при менделевском наследовании). Нередко экспрессивность моногенного синдрома зависит от пола пробанда. Результатом клинико-генеалогического обследования семьи является описание фенотипа, родословная, определение типа наследования патологии и предварительный диагноз. Во время составления родословной используются графические символы, поколения обозначаются римскими цифрами, начиная с поколения пробанда (0), а каждый человек в одном поколении – арабскими цифрами. Пробанд (лицо, которое обратилось к врачу) обозначается стрелкой. Таким образом, каждый человек в родословной имеет свой номер и отношение к определенному поколению.
После установления на 1 этапе предварительного диагноза (на основе клинико-генеалогического анализа) необходимо провести дифференцированную диагностику с подобными по клинике синдромами, генокопиями и фенотипическими проявлениями этой патологии, с целью верификации диагноза. Необходимы консультации специалистов различных специальностей: офтальмолога, невропатолога, психиатра, кардиолога, ортопеда и других, состав которых определяется в каждом конкретном случае.
Второй этап медико-генетического обследования подразумевает назначение пробанду и членам его семьи лабораторных и аппаратных исследований: рентгенографии черепа, конечностей, позвоночника (установление костного возраста, выявление аномалий); ультразвукового исследования; общих анализов крови и мочи; функциональное и лабораторное обследование сердечно-сосудистой, пищеварительной, дыхательной, иммунной, эндокринной, мочеполовой и центральной нервной систем. Необходимо помнить, что комплекс этих обследований в каждом конкретном случае основывается на конкретных гипотезах относительно диагноза, наличия или отсутствия изменений, которые характерны для предполагаемой патологии. В некоторых случаях решающим может быть результат анализа эндокринного статуса больного, в других – иммунного статуса или гистологического исследования биоптата. Установить диагноз в семьях, которые ранее имели случаи детской смертности, помогут протоколы вскрытия.
Большинство наследственных синдромов встречается в популяции чрезвычайно редко (1х103 – 1х106), поэтому для верификации диагноза необходимо сравнивать каждый конкретный случай с описанными в литературе (атласы, монографии, каталоги, компьютерные диагностические программы). В случае установления наследственной патологии точность диагностики определяет не только выбор правильной тактики лечения больного, прогноз его жизни и течения заболевания, но и успешность медико-генетического консультирования как больного (формирование адаптивной среды, выбор профессии, супружеской пары, прогноз деторождения), так и его членов семьи (своевременное выявление пораженных индивидов, преконцепционная профилактика, степень риска рождения больных детей).
Следовательно, диагностика наследственных болезней, успешность их лечения и профилактики зависит в большей степени от компетентности врача, владения им генетическим мышлением, чем от наличия дорогостоящей аппаратуры, реактивов и специализированных учреждений.
Лабораторные медико-генетические методы обследования имеют высокую чувствительность, что позволяет однозначно определить диагноз, характер и локализацию наследственного дефекта на уровне продукта гена, мутации в гене, хромосоме, геноме. Эти методы незаменимы при массовых скринингах патологии, пренатальной инвазивной диагностике, выявлении носителя патологического аллеля, установлении спорного отцовства, доклинической диагностике патологии.
1.Цитогенетический метод используется для исследования количества и качества структуры хромосом, выявления хромосомной патологии, мозаицизма, установления носителей сбалансированной хромосомной аномалии. Рождение современной цитогенетики человека можно датировать 1956 годом, когда Дж. Тийо и А. Леван предложили новую методику исследования хромосом, позволившую установить, что у человека 46 хромосом. Проведение цитогенетического анализа базируется на исследовании кариотипа человека. Кариотип – это совокупность морфологических особенностей полного хромосомного набора, типичного для клеток представителя данного биологического вида. Специфичность кариотипа определяется общим числом хромосом, их размером и формой, а числовая и структурная стабильность хромосом является наиболее важным условием формирования фенотипически нормального организма в процессе индивидуального развития.
Цель хромосомного анализа в клинической цитогенетике – оценка кариотипа с выявлением возможных количественных или структурных аномалий хромосом путем анализа метафазных или прометафазных препаратов хромосом и правильной записи и символизации. Эта система базируется на морфологических характеристиках хромосом, которые включают данные о размере хромосомы и положению центромеры. Согласно этих положений, хромосомы систематизируются по группам, которые обозначаются большими буквами английского алфавита от А до G, в порядке их длины. Заметный вклад в разработку этих методов внес отечественный ученый А.Ф. Захаров.
Благодаря выявлению в 1968 году линейной неоднородности хромосом по длине – чередование темно- и светлоокрашенных полос или сегментов (bands) с помощью использования дифференциальных методов окрашивания препаратов хромосом, стало возможным идентифицировать каждую индивидуальную хромосому (Caspersson, 1968). Эти методы получили название «стандартных методов хромосомного анализа» и базируются на специфической постфиксационной обработке готовых препаратов хромосом и изучении структуры хромосом на уровне 200-400 сегментов на гаплоидный набор.
С начала 80-х годов в практику цитогенетических лабораторий были введены новые методы исследования прометафазных хромосом, которые получили название «высокочувствительных методов», и позволяют изучить структуру хромосом на уровне 550-850 сегментов на гаплоидный набор. Получение прометафазных хромосом требует проведения высокотехнологических методик культивирования клеток и приготовления препаратов, а также высокой квалификации цитогенетика. На сегодняшний день практически все цитогенетические лаборатории мира проводят по показаниям анализ прометафазных хромосом.
В качестве экспресс-метода определения изменения количества половых хромосом часто проводят исследования полового хроматина (тельце Бара) в эпителиальных клетках слизистой щеки и других органов. Методика исследования заключается в том, что у пациента проводится соскоб слизистой щеки шпателем, наносится мазок на стекло, фиксируется и окрашивается ядерным красителем (Гимза, ацетоорсеином) и анализируется под микроскопом с иммерсией.
В клетках женских организмов одна половая хромосома в интерфазе чаще всего находится в конденсированном состоянии и при окраске клеток ацетоорсеином определяется у поверхности ядерной оболочки в виде глыбки (полового хроматина). В клетке количество глыбок полового хроматина на единицу меньше количества половых Х-хромосом в кариотипе.
У женщин с кариотипом 46,ХХ находят одну глыбку полового хроматина. При кариотипе 47,ХХХ в клетках находят две глыбки полового хроматина. У мужчин с кариотипом 47,ХХY – выявляется одна глыбка полового хроматина, как и у нормальной женщины. У нормального мужчины с кариотипом 46, ХY половой хроматин отсутствует вообще, как и у женщины с кариотипом 45, ХО.
Анализируется, как правило, 100 эпителиальных клеток, определяется число глыбок полового хроматина на 100 клеток эпителия, что и является процентом полового хроматина у конкретного пациента.
Половой хроматин определяется также и в сегментоядерных лейкоцитах в виде выроста ядра, так называемые «барабанные палочки», они обнаруживаются у женщин.
Следовательно, сегодня хромосомная патология исследуется в зависимости от необходимости на разных уровнях организации хромосом – от стандартных через высокочувствительные методы до молекулярно-цитогенетических методов.
Хромосомы хорошо видны после специальной окраски во время деления клеток, когда они максимально спирализованы. На стандартно приготовленных и равномерно окрашенных препаратах хромосом форма их определяется положением первичной перетяжки, которая делит каждую хромосому на два плеча. В области первичной перетяжки находится центромера – плотное тельце, к которому прикрепляется микротрубочки веретена деления во время митоза или мейоза. В зависимости от размещения первичной перетяжки и центромеры, различают хромосомы: метацентрические (центромера размещена практически посредине – оба плеча хромосомы равные), субметацентрические (центромера смещена со среднего положения – различают короткое (p) и длинное (q) плечи) и акроцентрические (центромера смещена в концевое положение), количественно форму хромосом можно характеризовать центромерным индексом (часть от деления длины короткого плеча на длину всей хромосомы, принятой за 100%). Некоторые акроцентрические хромосомы имеют так называемые спутники, которые в неделящейся клетке формируют ядрышки, которые содержат многочисленные копии рРНК.
При использовании методов дифференциального окрашивания в плечах каждой хромосомы можно установить линейную неоднородность по длине – чередование темно- и светлоокрашенных полос или сегментов (bands). Избирательное окрашивание и визуализация сегментов связаны с локализацией гетерохроматина, ДНК которого обогащена А-Т парами. Обозначения линейной структуры хромосом, согласно рекомендациям по номенклатуре хромосом человека 1971 и 1981 годов, (известных как Парижские), базируется на следующих принципах: каждая хромосома рассматривается как непрерывная совокупность темно- и светлоокрашенных сегментов: хромосомные плечи делятся на районы (regions), которые разделяются специфическими маркерами (landmarks); районы, в свою очередь, делятся на сегменты (bands) – районы хромосом, которые четко отличаются от соседних по интенсивности светлого или темного окрашивания. Районы и сегменты пронумерованы последовательно от центромеры до теломеры. При обозначении в записи кариотипа любых структурных перестроек хромосомы сначала пишут номер хромосомы, затем символ плеча «p» или «q», номер района и номер сегмента. При анализе препаратов прометафазных хромосом наблюдается разделение сегмента на подсегменты, которые также необходимо указывать при записи кариотипа.
Плечи хромосом заканчиваются теломерами – концевыми участками, функция которых заключается в защите концов ДНК от действия ферментов эндонуклеаз и в обеспечении взаимодействия концов хромосом с внутриядерным матриксом, то есть обеспечивают стабильность хромосом. Теломера содержит много копий последовательности Т2АG3, так называемых тандемных повторов, общей длиной 5-15 млн. пар оснований. В норме во время клеточного деления происходит уменьшение числа этих повторов в теломерах. Однако каждый раз они достраиваются с помощью специального фермента, который называется теломеразой.
Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку, которая выступает еще одним дополнительным морфологическим признаком хромосомы и, за исключением ядрышкового организатора акроцентрических хромосом, образуется за счет неполной конденсации районов структурного гетерохроматина. Их можно наблюдать в околоцентромерных районах длинных плеч хромосом 1, 9, 16.
В 1995 году опубликована последняя номенклатура хромосом человека (ISCN, 1995), которая отражает различные варианты хромосомных изменений в кариотипе человека на основе всех технологических возможностей, которые применяются в цитогенетике в последние годы. В нее впервые был внесен раздел, отражающий внедрение молекулярно-цитогенетических методов в анализ хромосом.
Принципы получения хромосом человека. Проведение цитогенетического исследования базируется на получении клеточной популяции с высокой митотической активностью. Для этого применяются прямые и непрямые методы.
Прямые методы предусматривают анализ клеток, которые непосредственно активно делятся в организме (клетки костного мозга, биоптат ворсиночного хориона, клетки опухолей, селезенки, мейотические клетки половых желез) и позволяет анализировать препараты хромосом через несколько часов после забора материала.
Непрямые методы – это предварительное культивирование в питательной среде клеток, полученных из организма (лимфоциты периферической крови; клетки амниотической жидкости; клетки, полученные из биоптата кожи; клетки из разных тканей абортированных эмбрионов; клетки ворсиночного хориона – длительное культивирование).
Анализ препаратов хромосом по стандартной методике предусматривает их окрашивание. Рутинное окрашивание хромосом проводится красителем Гимза и позволяет получать однородное окрашивание хромосом по всей длине.
К методам, с помощью которых можно выявить линейную неоднородность по длине, относятся Q-, G-, R-методы. В основе этих методов лежит использование специальных красителей, или предварительная термическая обработка препаратов хромосом, или обработка с помощью растворов протеолитических ферментов (трипсин, пепсин и др.) или солей (2хSSC).
Исторически первым методом дифференциального окрашивания был Q-метод, который принадлежит к флуоресцентному методу дифференциального окрашивания, и основан на использовании флуоресцентных красителей с изучением препаратов хромосом в люминисцентном микроскопе. Данный метод позволяет идентифицировать индивидуальные хромосомы, выявлять структурные аномалии при проведении пре- и постнатальной диагностики, выявить полиморфизм в перицентромерных районах хромосом 3 и 4, перицентромерных районах и сателлитах акроцентрических хромосом (13-15 и 21-22) и в дистальном отделе длинного плеча хромосомы Y.
Наиболее применяемым методом дифференциального окрашивания в медицинской практике является – G-метод. Данный метод используется для идентификации индивидуальных хромосом и выявления структурных аномалий хромосом, характер сегментации при G-методе подобен сегментации при Q-методе.
При R-методе рисунок сегментации противоположен рисунку сегментации, который получается после G- и Q-методов окрашивания. R-метод окраскиносит название обратного бэндинга, применяется в тех же случаях, что и G-метод и позволяет визуализировать терминальные районы хромосом и R- позитивные сегменты,которые вовлечены в перестройку хромосом.
С-метод позволяет окрашивать центромерный район во всех хромосомах и гетерохроматин вторичных околоцентромерных перетяжек в хромосомах 1, 9, 16, гетерохроматин коротких плеч акроцентрических хромосом и длинного плеча хромосомы Y и используется для определения дицентрических хромосом, помогает идентифицировать некоторые прицентромерные инверсии, прицентромерный гетерохроматин в маркерных хромосомах, наличие Y-хромосомы в кариотипе. Разные методы дифференциального окрашивания по-разному отображают линейную организацию хромосом, поэтому для изучения структурных особенностей хромосом используется методика последовательного окрашивания Q-,G-, R-, C-методами.
В случаях сложных хромосомных перестроек, скрытых делеций при клинической картине определенного синдрома, связанного с микроструктурными аномалиями хромосом, наличием маркерных хромосом, необходимо дополнительно провести анализ кариотипа с использованием молекулярно-цитогенетических методов (флуоресцентная in situ гибридизация (FISH-диагностика)). Сегодня все цитогенетические лаборатории мира придерживаются правил последней номенклатуры для обозначения хромосомных аномалий, введение их в разные компьютерные программы и реестры.
Дата добавления: 2015-04-20; просмотров: 26 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |