Читайте также:
|
Молекулярно-генетическая диагностика – обнаружение в клиническом материале фрагментов нуклеиновых кислот вирусов-возбудителей с помощью зондов (методы молекулярной гибридизация нуклеиновых кислот) или полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Методы молекулярной биологии получили свое развитие еще в 50-е годы XX столетия. Они стали возможными в связи с тем, что в геноме каждого микроорганизма имеются уникальные видоспецифичные нуклеотидные последовательности, обнаружив которые можно идентифицировать любой инфекционный агент. Наибольшее значение данные методы имеют при выявлении микроорганизмов, которые длительно или трудно культивируются обычными методами. В 70-е годы для выявления инфекционного возбудителя или мутации использовали ДНК-зондовую детекцию, основанную на гибридизации специфических олигонуклеотидных зондов, меченных радиоактивным изотопом (или флюорохромом) с образцом выделенной ДНК. Гибридизационный анализ использует способность нуклеиновых кислот в определенных условиях образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми же кислотами, имеющими комплиментарные к ним последовательности. Метод детекции инфекционных возбудителей ДНК-гибридизацией оказался крайне трудоемким, длительным и дорогостоящим. Кроме того, его чувствительность оказывается недостаточной при идентификации микроорганизмов в таких клинических материалах, как фекалии и моча. На смену ДНК-гибридизации пришел метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК.
Методы молекулярно-генетической индикации (методы молекулярной гибридизации – ММГ, полимеразная цепная реакция – ПЦР) основаны на выявлении специфических участков ДНК возбудителя в исследуемом материале.
Для детекции вирусов в воде из проб выделяют вирусную РНК методом аффинной сорбции (Boom et all, 1987) с последующей обратной транскрипцией и ПЦР: одностадийной в случае энтеровирусов и двустадийной в случае вируса гепатита А.
Возможности ПЦР:
1) одновременное обнаружение и идентификация патогенов;
2) выявление некультивируемых форм микроорганизмов;
3) оценка жизнеспособности возбудителя;
4) оценка вирулентности штаммов по наличию генов патогенности;
5) определение эпидемической значимости возбудителя;
6) определение источника инфекции и уточнение пути передачи.
При определении гомологии РНК водных и клинических штаммов ВГА путем секвенирования нуклеотидных последовательностей различных штаммов показана их идентичность в пределах от 90,4 % до 92,1 %, что подтверждает водный путь передачи возбудителя гепатита А.
Метод рестрикционного анализа хромосомной ДНК с использованием рестриктазы EcoRI на основе пульс-электрофореза позволяет разделять выделенные штаммы на группы по типу рестриктограммы. Полимеразная цепная реакция – это изящный метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК.
Открытие метода полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние годы.
Полимеразная цепная реакция – ПЦР (PCR – polymerase chain reaction)
Принцип метода заключается в естественной репликации ДНК, включающей тепловую денатурацию нуклеиновой кислоты (плавление), ее отжиг с синтетическими олигонуклеотидными праймерами и удлинение цепи (элонгация). Смена этих этапов происходит в результате простого изменения температуры реакционной смеси. Метод ПЦР обеспечивает многократное приумножение (амплификацию, amplification – усиление, увеличение) в условиях in vitro фрагментов генома и быстрое накопление практически в любых количествах определенной, интересующей исследователя последовательности ДНК, которая первоначально может быть представлена всего лишь одной молекулой. В результате получают количество материала, достаточное для проведения анализа обычными методами детекции. Сущность метода ПЦР составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий полимеразную реакцию и денатурацию синтезированного фрагмента двунитевой ДНК и отжиг праймеров, что, в конечном счете, может привести к неограниченному увеличению исходного материала.
Реактивы (компоненты реакционной смеси).
1 Праймеры – синтетические олигонуклеотиды, состоящие из нуклеотидов в количестве от 18 до 25, комплиментарных сайтам (участкам) на идентифицируемой матричной ДНК. Синтез праймеров – довольно трудоемкий процесс. В настоящее время подбор последовательности обеспечивается автоматически с использованием соответствующих компьютерных программ. Выбор праймеров является наиболее важным звеном ПЦР, так как именно ими определяется возможность амплификации и выявления нужной последовательности. Особенно важно наличие комплиментарности 3' -концевых нуклеотидов праймеров в выявляемой генетической структуре, так как отсутствие данного условия приводит к резкому снижению (в десятки раз) эффективности присоединения к 3'-концу новых нуклеотидов, что, естественно затрудняет последующий рост полинуклеотидной цепи. Конструирование праймеров проводится после определения нуклеотидных последовательностей в исследуемой ДНК методом секвенирования. Существенным образом на успех ПЦР-диагностики влияет идлина амплифицируемого участка ДНК или РНК. В большинстве случаев она должна находиться в диапазоне от 100 до 300 нуклеотидов. Для подбора оптимальных условий ПЦР с выбранными праймерами применяют различные компьютерные программы, например, OLIGO. Для анализа сходства испытуемых ДНК с известными нуклеотидными последовательностями используют данные международных компьютерных банков Gen Bank и EMBL, поставляющих программы анализа DNASUN и DNASIS.
2 Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитидинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) – «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Необходимо помнить, что дНТФ при комнатной температуре легко распадаются, поэтому маточные их растворы разливают по 10 мкл и 20 мкл и хранят в замороженном состоянии при температуре от минус 20 °С до минус 70 °С. Для работы используют размороженные пробы (рабочие образцы), разведенные в 100 раз деионизированной водой (по 2 мкл каждого). Избыток угнетает активность полимеразы.
3 Taq-ДНК-полимераза (термостабильный фрагмент). Выделена из водорослей Thermus Aquaticus, живущих в горячих источниках, обладает ДНК-полимеразной активностью. Несколько лет назад удалось получить из бактерий Thermus Thermophilis Tth-полимеразу, которая выполняет целый ряд функций, в том числе обеспечивает репарацию и репликацию ДНК и обладает обратнотранскриптазной активностью, позволяя получать из РНК комплиментарную ДНК. Она способна удлинять короткие олигонуклеотидные последовательности (праймеры), присоединяя к их 3¢-концу дополнительный нуклеотид при условии, что праймер, как уже отмечалось, комплиментарен сайту цепи ДНК (матрице). Наращивание длины праймера с помощью полимеразы происходит до тех пор, пока не будет достигнут конец матрицы. Экспериментально доказано, что процесс амплификации происходит более эффективно при использовании Taq-ДНК-полимеразы.
4 Буферный раствор для обеспечения оптимальных условий работы.
5 Ионы магния (Mg2+) – катализатор фермента Taq-ДНК-полимеразы.
6 Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, служащий мишенью для последующего многократного копирования (например, ДНК микроорганизмов). При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
7 Положительный контроль – образец ДНК выделяемой биологической системы.
8 Минеральное масло – наслаивается па поверхность реакционной смеси для предотвращения испарения и разбрызгивания продуктов ПЦР в случаях, если не применяется амплификатор с горячей крышкой.
Приборы.
Важным фактором воспроизводимости реакции амплификации является приборное обеспечение. Основным прибором для проведения ПЦР является амплификатор (термоциклер), представляющий собой аппарат, в гнезда которого устанавливаются специальные амплификационные пробирки, изготовленные из особого термопроводимого пластика, с реакционной смесью или предметные стекла с образцами тканей. Различными фирмами выпускается большое количество разнообразных моделей амплификаторов. Модели отличаются друг от друга системами охлаждения (водяное, воздушное, фреоном и более надежное и современное – на полупроводниковых кристаллах), способами обогрева (передача тепла через пробирки с жидкостью и воздушная передача тепла в микроколориметр для обогрева срезов тканей, мазков и т.д.), объемом памяти при программировании, режимами регулирования смены температуры (по матрице, активное), количеством платформ (от 1 до 4) – такие модели осуществляют амплификацию по одной и той же программе на нескольких платформах сразу, что позволяет увеличивать число анализируемых одновременно проб или проводить амплификацию на разных платформах по нескольким разным программам для одновременного анализа проб на наличие нескольких типов возбудителей.
Кроме надежности амплификатора и точности поддержания температуры, следует упомянуть о таком важном свойстве приборов, как использование активного регулирования, позволяющего добиваться достижения нужной температуры реакционной смеси внутри пробирки в существенно более короткие сроки, чем при обычном регулировании. Использование активных методов регулирования температуры реакционной смеси (в отличие от метода регулирования по матрице) позволяет значительно сокращать процесс амплификации: тем самым уменьшается время реакции (от 1,5 до 2 раз), увеличивается время сохранения активности Taq-ДНК-полимеразы, что позволяет увеличить количество циклов амплификации, снизить риск неспецифического отжига праймеров, а, следовательно, повысить чувствительность и специфичность реакции.
Регулирование по матрице – классический вариант регулирования, при котором заданный в программе амплификации температурный профиль трактуется как температурный профиль термоблока (матрицы). В этом случае реальная температура реакционной смеси в пробирке может существенно отличаться от температуры термоблока из-за плохой термопроводности стенок пробирки, наличия контактного теплового сопротивления между матрицей и пробиркой, конечной скорости распространения тепла внутри объема смеси, т.е. ограниченной скорости теплообмена между матрицей и пробиркой со смесью. Данный метод был наиболее распространен до последнего времени. При таком регулировании температуры реакционной смеси необходимы довольно продолжительные участки поддержания постоянной температуры матрицы для того, чтобы температура смеси успела выйти на заданный уровень (от 0,5 до 2 мин в зависимости от необходимой точности).
Активный метод регулирования ориентируется на более эффективное достижение конечной цели: установление заданной температуры реакционной смеси основывается на том, что программой непосредственно задается температура реакционной смеси и время удержания смеси при этой температуре. Температура внутри пробирки вычисляется на основе измерения температуры термоблока и известного (заданного в программе) объема реакционной смеси. Такой подход позволяет существенно сократить время реакции, поскольку в этом случае регулирование температуры матрицы осуществляется так, чтобы обеспечить наиболее эффективные температурные переходы в реакционной смеси. Известно несколько модификаций метода активного регулирования; активное регулирование повышенной точности – алгоритм, позволяющий свести к минимуму неравномерность температуры внутри пробирок (не более 0,5 °С); быстрое активное регулирование – алгоритм, допускающий неравномерность температуры в пробирке в пределах ± 1,5 °С, но существенно экономит время.
Другие приборы, необходимые для проведения исследования: центрифуга, ламинарный шкаф, водяная баня или термоблок, аппарат для электрофореза, денситометр.
Оптимизация проведения ПЦР.
Важную роль в проведении ПЦР играет оптимизация таких факторов, как число циклов амплификации, временные и температурные характеристики процесса, концентрация искомых последовательностей нуклеиновых кислот, концентрация ионов магния, дезоксинуклеозидтрифосфатов, ДНК-полимеразы.
Циклический температурный режим. Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в ходе реакции амплификации с ней происходит ряд процессов, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Параметры температурного режима играют исключительно важную роль для успешного проведения реакции. Для того, чтобы осознать, сколь сложным было решение этой задачи, укажем, что К. Мюллис работал над ней совместно с математиком Ф. Фалуном несколько месяцев.
Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов; денатурации, отжига (annealing) и синтеза (достройки).
Денатурация. В результате нагревания (обычно от 90 °С до 95 °С в течение от 40 до 50 с) двойная цепь ДНК разделяется на 2 отдельные цепи. Многими исследователями рекомендуется более длительный начальный прогрев реакционной смеси (от 93 °С до 95 °С до 5 мин), который обеспечивает полную денатурацию всех молекул ДНК в образце. Последующие этапы плавления занимают меньше времени.
Отжиг или присоединение праймеров.
На данном этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название «отжиг», которое происходит от английского термина «annealing», используемого в металлургии и означающего охлаждение сплавов в определенном режиме. Праймеры состоят обычно из нуклеотидов в количестве от 20 до 30, их подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплиментарны противоположным цепям ДНК. При создании оптимальной температуры (обычно от 40 °С до 65 °С) происходит комплиментарное связывание праймеров с соответствующими участками ДНК: один праймер на одной цепи, другой на противоположной цепи ДНК. Отжиг протекает в соответствии с правилом комплиментарности Чаргаффа, означающим, что в двух цепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина – цитозин. Если данное условие не соблюдено, то отжига не происходит.
На практике температура отжига подбирается опытным путем с использованием положительных и отрицательных контролей. Она находится в диапазоне от 40 °С до 65 °С.
После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3'-конца праймера.
Элонгация (синтез).
На данном этапе происходит достраивание праймеров. Температуру реакционной смеси доводят до оптимальной для активности Taq-ДНК-полимеразы (около 72 °С), которая начинает достраивание второй цепи ДНК из дНТФ. Синтез всегда начинается от 3'-конца каждого праймера. Достраивание новой нити ДНК идет, таким образом, от 5'-конца к 3'-концу каждой имеющейся нити ДНК, т.е. синтез, протекает в противоположных друг другу направлениях. Именно поэтому классическую ПЦР называют методом направленной амплификации. Время, необходимое для элонгации, определяется размером продуктов амплификации. Считается, что достраивание 1000 пар нуклеотидов занимает 1 мин. Обычно оно занимает от 40 до 60 с.
В завершение первого цикла ПЦР из одной образуются две новые молекулы ДНК, идентичные оригиналу, но не по всей длине ДНК, а только в тех участках, которые ограничены присоединением праймеров. То есть дочерние молекулы ДНК идентичны не всей материнской ДНК, а только ее части.
Следует отметить, что во время первого цикла удлинение новой цепочки от праймера заканчивается произвольно. Однако со второго цикла в смеси начинают накапливаться специфические продукты амплификации – ампликоны, которые ограничены по длине двумя праймерами. Именно они и являются непосредственным предметом детекции, которую проводят с помощью электрофореза либо иммуноферментного анализа.
Во втором цикле ПЦР два синтезированных участка ДНК, образованные из одной материнской ДНК, также служат матрицей (шаблоном) для последующих циклов ПЦР. Начиная с третьего цикла, в процессе синтеза образуются отрезки ДНК (ампликоны) со строго определенным количеством нуклеотидных последовательностей и, соответственно, с определенной молекулярной массой, что позволяет в процессе классического метода детекции – гель-электрофореза, легко выявить такие ампликоны. В случае близкого значения температуры отжига праймеров к температуре, оптимальной для действия фермента, иногда становится возможным использовать 2-стадийный цикл ПЦР, совместив две стадии (отжиг и элонгацию) в одной.
3-стадийный цикл (денатурация, отжиг, элонгация), длящийся от 2 до 3 мин при использовании амплификаторов, регулируемых по матрице, или от 30 до 40 с при применении современных термоциклеров, работающих по принципу активного регулирования, может быть повторен многократно. 1 цикл ПЦР дает две копии ДНК, затем 4, 8, 16 и т.д., т.е. в результате каждого проведенного цикла количество синтезированных копий удваивается. Данный процесс повторяют от 20 до 30 раз, что обеспечивает синтез как минимум 1 млн. копий.
Дата добавления: 2015-04-20; просмотров: 27 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |