Студопедия  
Главная страница | Контакты | Случайная страница

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Восходящей хроматографии

 

Цель работы: разделение и идентификация аминокислот в исследуемом образце методом восходящей хроматографии.

Метод основан на различной способности аминокислот к растворению в органических растворителях и воде, обусловленной их структурными особенностями.

В процессе хроматографии органический растворитель, перемещаясь вдоль фильтровальной бумаги, увлекает растворенные в нем аминокислоты.

Каждая аминокислота проходит определенное расстояние. Отношение этого расстояния к расстоянию, пройденному фронтом растворителя, называется коэффициентом Rf.

В воздушно-сухом состоянии фильтровальная бумага cодержит до 20 – 25 % воды. Эта вода является неподвижной фазой распределения. Подвижная фаза распределения – органический растворитель. Фильтровальная бумага выполняет функции хроматографической колонки, через которую проходит растворитель и растворенная в нем смесь аминокислот. Чем больше растворимость аминокислоты в органическом растворителе, тем дальше пройдет эта аминокислота и тем ближе подойдет к фронту растворителя.

Оборудование и реактивы:стеклянные хроматографические колонки; фильтровальная бумага; ножницы; карандаш; линейка; пипетки; колбы; фарфоровые ступки; технические весы; сушильный шкаф; фенол, насыщенный водой (отношение фенола к воде составляет 2:1); раствор нингидрина в ацетоне с массовой долей 0,4% или раствор нингидрина в этаноле с массовой долей 0,1%; исследуемый раствор аминокислот; яблоко, лук, морковь (1 г исследуемого материала растирают в фарфоровой ступке с песком, экстрагируют с 4 см3 этанола, фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат используют для исследования); молочная сыворотка, освобожденная от белков и высокомолекулярных пептидов (к 20 см3 сыворотки добавляют 1 см3 раствора трихлоруксусной кислоты с массовой долей 50 %, оставляют на 30 мин для осаждения высокомолекулярных белковых веществ, отделяют осадок фильтрованием, фильтрат используют для анализа).

Ход работы:

Хроматографическую (фильтровальную) бумагу разрезают на полосы шириной 2 – 3 см и длиной, соответствующей высоте хроматографичесокой колонки. Волокна хроматографической бумаги должны располагаться вдоль. На расстоянии 1 – 2 см от края бумажной полоски отмечают карандашом стартовую линию. На бумагу вдоль стартовой линии наносят исследуемый раствор аминокислот. Одновременно на другие полоски наносят растворы стандартных аминокислот – маркеров. Бумажные полоски просушивают на воздухе.

Подготовленные пробы помещают в хроматографическую колонку для разделения. Предварительно на дно колонки наливают органический растворитель – насыщенный водой раствор фенола. Закрепляют бумажные полосы так, чтобы нижний конец был погружен в растворитель (но не касался линии старта!). Герметически закрывают крышку хроматографической колонки. Через 2 ч бумажные полосы извлекают из сосуда, отмечают фронт растворителя и высушивают в сушильном шкафу при 100°С в течение 10 – 15 мин. Хроматограммы проявляют нингидрином и снова подсушивают при 100 °С в течение 5 – 10 мин.

Аминокислоты в процессе реакции с нингидрином приобретают сине-фиолетовую специфическую окраску и располагаются в виде пятен по длине бумажных полос.

Так как фронт движения для каждой аминокислоты вполне определенный и характеризуется коэффициентом Rf, находят коэффициент и идентифицируют каждую аминокислоту, используя маркеры. Результаты исследований вносят в таблицу 16.

 

Таблица 16. Идентификация аминокислот

Наименование объекта исследования Фронт, пройденный аминокислотой, см Коэффициент Rf Присутствие в исследуемом объекте
Глицин Лизин Аспарагиновая кислота      

Вопросы для самоконтроля

1. Расскажите о механизме действия в организме человека ферментов трипсина и пепсина.

2. На чём основано определение белков по методу Лоури?

3. Как построить калибровочную кривую при использовании метода Лоури?

4. На чём основано разделение аминокислот методом восходящей хроматографии?

5. Сущность определения белка рефрактометрическим способом.

6. В чём состоит сущность метода формольного титрования?

7. Перечислите методы количественного определения белка. На каких принципах они основаны?


Дата добавления: 2015-09-11; просмотров: 8 | Нарушение авторских прав

Показателей качества воды | Определение общего количества бактерий в воде | Отбор проб воды | Определение санитарно-значимых бактерий в воде | Определение массовой доли влаги в продуктах и сырье | Гидролиз белка пищеварительными ферментами | Определение содержания белка по методу Лоури | Определение содержания белка | Определение массовой доли белка методом Кофрани | Отдельных аминокислот |


lektsii.net - Лекции.Нет - 2014-2020 год. (0.008 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав