Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Мутант CTGG CTGG CTGG CTGG

Некоторые мобильные генетические элементы имеют предпочтительные участки включения, играющие роль горячих точек мутаций. Такие участки различаются для разных подвижных элементов, хотя большинство мобильных элементов включается в ДНК случайным образом.

Частота мутирования

Спонтанные мутации, инактивирующие функцию гена, возникают у бактерий с частотой 10^-6-10^-7 т.е. один раз за время одной репликации в расчете на один локус.

Точных данных относительно скорости мутирования в случае эукариот в настоящее время нет. Однако обычно считают, что она примерно совпадает с таковой у бактерий. Не известно также какова доля спонтанных мутаций у бактерий обусловлена точечными мутациями, а какова – включениями мобильных элементов. Ясно только, что оба процесса играют в мутировании важную роль.

в случае бактериальных генов, содержащих 1.000 пар оснований каждый, частота мутирования соответствует изменению одного нуклеотида из 10⁹ - 10¹⁰ нуклеотидов в расчете на одно поколение. Если говорить только о точечных мутациях, такой подсчет является сильным упрощением ситуации, поскольку не все мутации приводят к регистрируемому изменению фенотипа.

Мутации, не приводящие к заметным изменениям фенотипа, называют молчащими мутациями. Молчащие мутации могут быть двух типов:

1) В первом случае замена одного основания на другое не приводит к замене аминокислоты в белке (более подробно реализация такой возможности рассмотрена в главе, описывающей биосинтез белка. В частности, вырожденность кода и реализация неоднозначного соответствия позволяют в процессе мутирования сохранить аминокислотный состав белка);

2) Во втором случае замена основания в ДНК вызывает замену соответствующей аминокислоты в белке, но эта замена аминокислоты не влияет на функциональные свойства белка. Молчащие мутации второго типа называют нейтральными мутациями.

Мутации, инактивирующие ген и, следовательно, приводящие к изменению функции белка - это прямые мутации. Повреждения, вызванные прямыми мутациями могут быть устранены в результате обратных мутаций, которые также подразделяются на два типа:

1) Точное восстановление исходной структуры ДНК называют истинной обратной мутацией (истинная реверсия). Например, если пара А-Т заменяется парой G-C, другая мутация, восстановившая пару А-Т, восстановит и аминокислотную последовательность дикого типа в белке;

2) С другой стороны, эффект мутации в одном месте гена может быть компенсирован мутацией в другом месте этого же гена (вторичная реверсия).

Частота обратных мутаций существенно ниже, чем прямых, и обычно составляет величину в 10 раз меньшую.

Иногда мутации, возникающие в определенных генах, помогают каким-то образом обойти или нейтрализовать эффект первой мутации, появившейся в другом гене. Таким образом, как можно видеть, существует еще один тип мутаций, называемых супрессорными мутациями, когда повреждающий эффект мутации в одном гене, компенсируется мутацией в другом гене.

Кроме того, необходимо указать на существование мутаций, которые называют условно-летальными мутациями. Эти мутации, будучи летальными в одних условиях, либо совсем не влияют на жизнеспособность клетки, либо оказывают более слабое действие в других условиях, обеспечивающих продолжение жизни клетки. Все зависит от конкретных условий, в которых оказалась клетка. При выращивании бактериальных клеток с такими мутациями в пермессивных условиях мутантный фенотип не проявляется. При выращивании клеток в непермессивных условиях мутация становится летальной или клетка становится совершенно «больной». Тем не менее, если гибель таких клеток с условно-летальными мутациями наступает не сразу, эти клетки можно исследовать, а значит попытаться установить природу возникновения мутаций данного типа.

Причины мутаций

Точечные мутации, суть которых связана с заменами одной пары оснований на другую пару, могут быть вызваны самыми различными причинами. К числу наиболее известных и хорошо изученных факторов, вызывающих появление точечных мутаций относятся нижеследующие.

Ошибки репликации, не исправленные ДНК-полимеразой. Как известно, точность копирования в процессе репликации ДНК настолько велика, что в среднем на каждые 1 10 ⁹ пар нуклеотидов приходится одна ошибка. Такую высокую точность репликации обеспечивает корректирующая (3′ ® 5′)-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы. Тем не менее, в ряде случаев ДНК-полимераза может ошибаться. Одной из причин таких ошибок является способность всех азотистых оснований образовывать термодинамически невыгодные таутомерные формы за счет миграции атома водорода. При этом амино- и оксогруппы превращаются в иминогруппы (=NH) и енольные группы (-ОН), соответственно. Такие редкие таутомерные формы, как правило, образуют неправильные, неканонические пары с другими основаниями. Примером может служить способность Cyt образовывать редкую таутомерную имино-форму, приведенную на рис 5.4.

Эта имино-форма Cyt образует пару не с Gua, а с Ade. В результате, в процессе последующей репликации, может произойти замена пары A-T на G-C. Точно также аденин способен образовывать редкую таутомерную имино-форму, которая приобретает способность комплементарно спариваться с неканоническим для него цитозином (рис. 5.5).

Процессы спонтанного дезаминирования обычных и модифицированных оснований. В настоящее время хорошо известно, что некоторая часть оснований, входящих в состав ДНК как про-, так и эукариот метилируется пострепликативно особыми ферментами - метилазами. Цели метилирования у про- и эукариот различны, но эта модификация ДНК протекает достаточно интенсивно. Чаще всего метилированию подвергаются остатки Ade и Cyt. Ранее нами была рассмотрена схема, показывающая последовательность событий приводящих к возникновению транзиции G-C ® A-T вследствие спонтанного или индуцированного дезаминирования цитозина (рис. 5.1), а также причины существования горячих точек.

Например, если дезаминированию подвергается не цитозин, а 5-метилцитозин, то этот процесс приводит к образованию нормального для днк основания – тимина (Thy). Естественно, что в этом случае при повторной репликации возможна замена пары G-C на пару A-T. Было обнаружено, что процессы спонтанного дезаминирования происходят с определенной достаточно высокой скоростью, которая составляет 100 актов дезаминирования на один геном в сутки.

Процессы апуринизации ДНК. ДНК каждой клетки человеческого организма в результате апуринизации теряет в сутки около 5.000 пуриновых оснований (Ade и Gua) вследствие термального разрыва N-гликозидных связей между пуриновым основанием и дезоксирибозой. Удаление пиримидиновых оснований из ДНК в какой-либо ощутимой степени не происходит из-за того, что N-гликозидные связи пиримидинов с углеводной частью намного более стабильны, чем связь пурина с углеводом. На интенсивность процесса апуринизации ДНК могут влиять также различные химические факторы. Например, в кислой среде эффективность апуринизации ДНК существенно возрастает. Алкилирование гуанина под действием диметилсульфата приводит к образованию четвертичного азота в 7-ом положении этого азотистого основания, что ослабляет N-гликозидную связь с дезоксирибозой и высвобождает метильное производное гуанина, обеспечивая дополнительную потерю пуринов молекулами ДНК (рис. 5.6).

.

Повреждения ДНК, вызываемые действием химических факторов окружающей среды. Основания в составе ДНК весьма чувствительны к действию многочисленных химических соединений, распространенных в окружающей среде. Многие из них получили название ксенобиотиков, большинство которых имеет антропогенное техногенное происхождение. К разряду ксенобиотиков относятся многочисленные яды, лекарства, канцерогены, пестициды, инсектициды, гербициды и многие другие соединения. Среди эффектов различных соединений наиболее полно изучено воздействие азотистой кислоты (HNO₂) (рис. 5.3), гидроксиламина (NH₂OH) (рис.5.7), алкилирующих агентов, таких как диметилсульфат (рис. 5.6), N-метил-N^/-нитро-N-нитрозогуанидин:

.

Под действием азотистой кислоты, которая может образовываться из таких предшественников как NaNO₂ - нитрит натрия, NaNO₃ - нитрат натрия, а также органических соединений типа нитрозаминов

происходит активное дезаминирование Cyt с образованием Ura, Ade с образованием гипоксантина (Hyp) и Gua с образованием ксантина (Xan). В результате дезаминирования Cyt образуется, как уже известно, Ura, который комплементарно спаривается с Ade. В результате происходит транзиция G-C ® A-T.

С другой стороны, в результате дезаминирования Ade образуется Hyp, который приобретает способность спариваться с Cyt, вызывая транзицию A-T ® G-C. если события, касающиеся дезаминирования, произойдут в одном сайте, т.е. сначала дезаминированию подвергнется Cyt и произойдет образование A-T пары вместо G-C, а затем дезаминированию подвергнется появившийся Ade и произойдет обратная транзиция A-T ® G-C, то при этом последовательность ДНК восстановится.

Дезаминирование Gua в Xan не влияет на способность измененного основания образовывать пару с цитозином (Xan – Cyt).

Алкилирующие агенты могут воздействовать как на структуру оснований, так могут разрушать и фосфодиэфирные связи, приводя к фрагментированию цепей ДНК. Кроме того, некоторые алкилирующие агенты способны ковалентно взаимодействовать с обеими цепями ДНК, вызывая образование поперечных сшивок.

Кроме упомянутого выше диметилсульфата, к числу наиболее активных алкилирующих агентов относятся диметилнитрозамин и азотистый иприт:

В результате воздействия алкилирующих (как метилирующих, так и этилирующих) агентов может происходить метилирование Gua по 7-положению, что приводит к образованию 7-метилгуанина (рис. 5.8), который впоследствие образует неканоническую пару с тимином. С тимином также может спариваться 7-этилгуанин.

Образование неканонической пары между тимином и 7-этилгуанином показано на рис. 5.9.

Кроме приведенных выше способов модификации гуанина, это азотистое основание может также метилироваться по гидроксильной группе енольной формы с образованием O⁶-метил-Gua, не способного образовывать нормальную комплементарную пару с Cyt. В свою очередь, метилирование аденина по аминогруппе приводит к образованию N⁶-метиладенина.

ОшибкиДНК-полимеразы,связанныес включением аналогов природных нуклеотидов. Одним из аналогов природных нуклеотидов, не выщепляемых ДНК-полимеразой является нуклеотид с азотистым основанием - 2-аминопурином (рис. 5.10), который встраивается в ДНК вместо Ade, но впоследствии спаривается с цитозином и тем самым способствует транзиции A-T ® G-C.

Несмотря на высокую точность функционирования ДНК-полимераз при катализе репликации эти ферменты не всегда способны отличать нормальные дезоксирибонуклеозид трифосфатные субстраты от некоторых других нуклеотидов с очень похожей структурой. Следует отметить, что в случае 2-аминопурина ДНК-полимераза все же делает существенную ошибку, поскольку наличие NH₂-группы во 2-ом или в 6-ом положениях пурина структурно является очень заметным. На рис. 5.11, приведенном ниже, представлена схема возникновения транзиции A-T ® G-C, инициируемая встраиванием 2-аминопурина.

Другой пример таких структурных аналогов природных нуклеозидтрифосфатов – 5-Br-dUTP (5-Br-дезоксиуридинтрифосфат), который является аналогом тимидинтрифосфата из-за присутствия атома Br в 5-положении урацила, где у тимина находится CH₃-группа. Первоначально 5-галоидпроизводные урацила были синтезированы как аналоги тимина с целью их возможного применения в качестве цитостатиков или противовирусных средств. В частности цитостатические эффекты 5-Br-dUrd сводятся к эффективному фосфорилированию данного аналога тимидина под действием тимидинкиназы поврежденной клетки и встраиванию этого модифицированного нуклеотида в ДНК. В результате последующего облучения клеток ультрафиолетовым светом встроенный 5-Br-Ura принимает участие в образовании большого числа пиримидиновых димеров и поперечных сшивок в ДНК, что практически полностью блокирует возможность репликации или транскрипции ДНК. Ситуация с 5-Br–dUrd, как соединением способным инициировать транзиции, менее однозначна, чем в случае 2-аминопурина. Дело в том, что 5-Br-dUrd может образовывать кето- и енольную формы. Минорная енольная форма 5-Br-Ura (рис. 5.12) возникает чаще, чем такая же форма тимина, из-за большей электроотрицательности Br по сравнению CH₃-группой тимина.

Поэтому, более часто образуемая енольная форма 5-Br-Ura имеет тенденцию спариваться с Gua, что приводит к транзиции A-T ® G-C. в норме же, кето-форма 5-Br-Ura, являющегося аналогом тимина спаривается с Ade (рис. 5.13).

Схема, иллюстрирующая последовательность этапов приводящих к транзиции A-T ® G-C, вызванной енолизацией встроенного в ДНК 5-Br-Ura показана на рис. 5.14.

Явление интеркаляции. Некоторые органические соединения, которые характеризуются плоской ароматической структурой с соответствующей геометрией и размерами могут встраиваться в ДНК между парами оснований - интеркалировать. В результате интеркаляции, эти соединения вызывают появление вставок или делеций одной или более пар оснований и тем самым приводят к изменению рамки считывания, если только вставки и делеции не кратны трем парам оснований. К таким интеркалирующим соединениям относятся акридины и этидий бромид (рис. 5.15).

Рентгеноструктурный анализ комплексов таких соединений с синтетическими двухцепочечными олигонуклеотидами показывает, что плоские ароматические кольца акридиновых красителей внедряются между парами оснований двойной спирали. Механизм внедрения предполагает проникновение молекулы красителя между парами оснований в момент возникновения локального нарушения структуры, при этом водородные связи между парами оснований сохраняются, тогда как «стэкинг»- взаимодействия нарушаются.

Одним из вариантов такого нарушения структуры ДНК вследствие интеркаляции акридиновых красителей или этидий бромида является образование изломов двойной спирали в молекуле ДНК, которые получили название кинков.

Химический канцерогенез. В настоящее время многие эксперты считают, что в подавляющем большинстве случаев заболевание раком инициируется воздействием на нуклеиновые кислоты определенных химических соединений. Канцерогенные вещества поступают в окружающую среду не только благодаря синтезу и использованию новых химических соединений в промышленных масштабах. Канцерогенами являются также многие соединения естественного происхождения. Например, известными канцерогенами являются афлатоксины, продуцируемые некоторыми плесневыми грибками. Несмотря на то, что интенсивное изучение микотоксинов началось сравнительно недавно, к настоящему времени уже описано более 300 таких соединений, относящихся к 25 различным типам. Даже в небольших дозах микотоксины оказывают разнообразные токсические эффекты на человека и животных, приводят к деградации печени, геморрагии и карциноме. В качестве главных по опасности микотоксинов сейчас рассматривают группу метаболитов гриба Aspergillus flavus – афлатоксинов, из которых наиболее коварны афлатоксин В₁ и продукт его метаболического гидроксилирования в организме коровы, проникающий в молоко – афлатоксин М₁ (рис. 5.16). Доказано, что эти соединения являются причиной цирроза и рака печени у людей. Механизм действия афлатоксинов состоит в том, что они после 15,16-эпоксидирования с участием печеночного цитохрома Р-450 ковалентно связываются с РНК, блокируя синтез белка.

К другой группе канцерогенов, имеющих естественное происхождение, относятся такие соединения, как бензпирен и бензантрацен, являющиеся постоянными компонентами табачного дыма, а также копченых продуктов питания и продуктов приготовляемых на углях. Хорошо известно, что некоторые канцерогены характеризуются непосредственным воздействием на нуклеиновые кислоты, тогда как другие (бензпирен и бензантрацен сами по себе являются слабыми канцерогенами) прежде, чем стать канцерогенными, должны пройти стадию активации посредством гидроксилирования и эпоксидирования с участием монооксигеназных систем печени. Ферменты, которые катализируют активацию канцерогенов, принадлежат к семейству цитохромов P-450. Как было показано, конечным продуктом активации бензпирена является вещество обладающее мощным канцерогенным действием на человека и животных и сильнейшим мутагенным эффектом на бактериальные клетки. Это соединение представляет собой 7,8-дигидродиол-9,10-эпоксид бензпирена. Схема реакций, приводящих к метаболической активации бензпирена приведена на рис. 5.17.

На первой стадии в описываемой последовательности реакций бензпирен под действием цитохрома Р-450 превращается в 7,8-эпоксид, который далее с участием эпоксидгидролазы присоединяет воду с образованием 7,8-дигидродиола бензпирена. На последней стадии, катализируемой также цитохромом Р-450 образуется конечное соединение 7,8-дигидродиол-9,10-эпоксид бензпирена.

Следует иметь в виду, что цитохромы P-450 обладают уникальной способностью индуцироваться неканцерогенными соединениями, такими как этанол. Следовательно, алкоголь может в значительной степени увеличивать потенциальный риск рака в результате воздействия канцерогенов.

Мутагенное действие физических факторов (X-лучи, УФ-, g-излучение). Как ультрафиолетовое, так и рентгеновское излучения являются сильнейшими мутагенными средствами. Нормальные основания, входящие в состав ДНК, представлены, как известно, в виде кето- и амино-форм, находящихся в равновесии с очень небольшими количествами минорных енольной и имино-форм. Энергия УФ и X-лучей сдвигает это равновесие в сторону образования минорных таутомерных форм. В результате чего повышенное содержание редких таутомерных форм Ade и Cyt увеличивает частоту их спаривания с Cyt и Ade, соответственно (рис. 5.4 и 5.5). Считают, что повышенное количество енольных форм оснований в момент репликации значительно повышает частоту мутаций в новосинтезируемых цепях ДНК.

Действие на ДНК жесткого излучения типа рентгеновских лучей и g-излучения может приводить к изменению структуры оснований. Результатом такого воздействия может быть раскрытие гетероциклов, разрушение фосфодиэфирных связей. В присутствии кислорода накапливается большое количество продуктов окисления азотистых оснований и остатков дезоксирибозы.

При воздействии УФ-света, кроме сдвига равновесия в сторону образования минорных таутомерных форм оснований происходит также появление, в первую очередь, тиминовых димеров (рис. 5.18), хотя в принципе возможно образование ковалентно сшитых пар не только T-T, но также T-C и C-C.

Репарация ошибок спаривания (mismatch)

Система коррекции редко встречающихся несоответствий спаривания оснований остающихся после репликации ДНК E. coli «увеличивает общую точность» копирования данной информационной молекулы на величину, равную 10² – 10³. При этом, учитывая, что в результате репликации в дочерних двухцепочечных ДНК могут появляться неканонические пары оснований, данная система репарации должна уметь отличать присутствие «правильного» основания в материнской цепи от неканонического «неправильного» таутомерного основания в новосинтезированной дочерней цепи. Для этого клетка использует особый принцип мечения исходной материнской цепи путем ее метилирования по отдельным основаниям. Система репарации ошибочного спаривания оснований у E. coli состоит, по крайней мере, из 12 различных белков, которые включаются как в процесс распознавания матричной цепи, так и в процесс самой репарации.

Механизм распознавания матричной и новосинтезированной цепей ДНК не известен у большинства бактерий и, тем более, у эукариот, однако, достаточно неплохо охарактеризован у E. coli и некоторых родственных ей микроорганизмов. Так, у E. coli в процессе распознавания цепей в дочерней ДНК принимает участие, уже известная, Dam-метилаза, которая метилирует остатки аденина по N⁶-положению во всех последовательностях (5^/)GATC. Cразу после прохождения репликативной вилки имеется малый промежуток времени (от нескольких секунд до нескольких минут) в течение которого последовательности (5^/)GATC в исходных материнских цепях метилированы, в то время как в дочерних цепях метилирование отсутствует. Преходящее неметилированное состояние последовательностей GATC в новосинтезированных цепях дает возможность клетке отличать их от материнских цепей в реплицированной молекуле ДНК. Затем ошибки репликации присутствующие поблизости от полуметилированного сайта GATC репарируются только в новосинтезированных цепях на основании того, что в родительской цепи указанная последовательность метилирована. Дополнительные эксперименты, проведенные in vitro, показали, что при наличии метилированных последовательностей GATC в обеих цепях реплицированной ДНК система коррекции несоответствий спаривания может исправить лишь незначительное количество таких ошибок. При отсутствии метилирования последовательностей GATC в обеих цепях процесс репарации осуществляется, но указанная система коррекции не отдавая предпочтения ни одной из двух цепей, сама делает при этом в половине случаев ошибки.

Клеточная система репарации несоответствий спаривания, функционирование которой зависит от степени метилирования ДНК, может исправлять указанные повреждения даже расположенные на расстоянии до 1.000 пар оснований от полуметилированной последовательности GATC.

Каким же образом процесс коррекции «плохой подгонки пар оснований» направляется последовательностями GATC, расположенными на достаточно большом расстоянии? Механизм данного процесса иллюстрирует схема, приведенная на рис. 2.

Как следует из рисунка, белок MutL образует комплекс с другим белком – MutS и данный двойной комплекс связывается со всеми неправильно спаренными основаниями (кроме пар С-С). В свою очередь, белок MutH взаимодействует с белком MutL и последовательностями GATC, на которые наталкивается комплекс MutL-MutS. Участки ДНК расположенные по обе стороны от обнаруженного повреждения «протягиваются» через комплекс MutL-MutS образуя петлю. В целом, синхронное продвижение через указанный комплекс белков участков ДНК прилегающих к образованной петле равносильно одновременному движению таких комплексов вдоль ДНК в противоположных направлениях. Характерная особенность белка MutH состоит в том, что он обладает сайт-специфической эндонуклеазной активностью, которая проявляется только тогда, когда весь тройной комплекс наталкивается на полуметилированный сайт GATC. В этом сайте MutH катализирует эндонуклеолитическое расщепление неметилированной цепи ДНК с 5^/-стороны гуанинового нуклеотида (G) последовательности GATC, которая метит цепь, подлежащую исправлению. Дальнейшие этапы репарации зависят от местоположения неправильно спаренных оснований относительно сайта расщепления (рис. 3).

Если неправильно спаренное основание находится на 5^/-стороне сайта расщепления, неметилированная цепь ДНК выплетается из двойной спирали и разрушается в направлении 3^/®5^/ от сайта расщепления, проходя через поврежденное основание. Утраченный сегмент ДНК замещается новым участком. Описанный процесс зависит от согласованного действия многих ферментов и вспомогательных белков: ДНК-геликазы II, SSB-белков, экзонуклеазы I или экзонуклеазы Х (оба фермента расщепляют цепи ДНК в направлении 3^/®5^/), ДНК-полимеразы III и ДНК-лигазы. Способ репарации неправильно спаренного основания расположенного на 3^/-стороне сайта расщепления напоминает описанный выше процесс за исключением необходимости участия другого набора экзонуклеаз. В этом случае поврежденный участок ДНК удаляется с помощью экзонуклеазы VII (способной деградировать одноцепочечную ДНК как в направлении 3^/®5^/, так и в направлении 5^/®3^/) или нуклеазы RecJ (деградирующей одноцепочечную ДНК в направлении 5^/®3^/).

Репарация неправильно спаренных оснований является весьма дорогостоящим процессом для клеток E. coli в смысле энергетических затрат. Как указывалось выше, неправильно спаренное основание может находиться на расстоянии в 1.000 или даже более пар оснований от последовательности GATC. Деградация и последующая замена одноцепочечного участка ДНК такой длины требует огромного расходования активированных предшественников дезоксирибонуклеотидов для репарации всего одного единственного неправильно спаренного основания. Приведенные рассуждения еще раз подчеркивают чрезвычайную важность сохранения целостности генома в клетке.

Системы коррекции несоответствий спаривания оснований остающихся после репликации ДНК также функционируют в клетках эукариотических организмов. При этом во всех эукариотических клетках обнаруживаются особые белки структурно и функционально аналогичные бактериальным белкам MutS и MutL (но не белку MutН). Мутации в генах человека, кодирующих белки аналогичного типа, служат причиной врожденной предрасположенности к развитию ряда общеизвестных злокачественных новообразований, еще раз подчеркивая огромное значение систем репарации ДНК для любого организма. Основными гомологами бактериального белка MutS у большинства эукариот, от дрожжей до человека, являются MSH2 ( M ut S h omolog 2), MSH3 и MSH6. В ходе репарации гетеродимеры белков MSH2 и MSH6, как правило, связываются с одним единственным неправильно спаренным основанием или, менее прочно и реже с несколько более протяженным участком ДНК, содержащим петлю, образование которой обусловлено присутствием нескольких неправильно спаренных оснований. В основном же более протяженные участки поврежденной ДНК, включающие от 2 до 6 неправильно спаренных оснований, узнаются гетеродимерами белков MSH2 и MSH3, или узнаются как димерами MSH2-MSH3, так и димерами MSH2-MSH6. При этом комплексы MSH стабилизируются путем связывания гомолога бактериального белка MutL, который представлен, главным образом, в виде гетеродимера, состоящего из белка MLH1 и белка PMS1 (название которого происходит от p ost- m eiotic s egregation). Более тонкие детали функционирования системы коррекции неправильно спаренных оснований у эукариот по-прежнему остаются предметом исследования. В частности, до сих пор неизвестно каким образом данная система репарации отличает дочернюю цепь ДНК от материнской, хотя уже установлено, что идентификация новосинтезированной цепи ДНК у эукариот не связана с последовательностью GATC.

Эксцизионная репарация оснований

Обычно все клетки живых организмов экспрессируют репарирующие ферменты определенного класса, называемые ДНК-гликозилазами, которые узнают наиболее общеизвестный тип повреждений ДНК связанный с процессом спонтанного дезаминирования цитозина (Cyt) или аденина (Ade) и удаляют измененное основание за счет расщепления N-гликозидной связи между дезаминированной формой основания и остатком дезоксирибозы. При этом фосфодиэфирные связи между этим остатком дезоксирибозы и соседними остатками дезоксисахаров сохраняются. Данный способ удаления измененных оснований создает, так называемые апуринизованные или апиримидинизованные сайты, которые обычно обозначают как АР-сайты. Установлено, что каждый вид ДНК-гликозилаз обладает высокой специфичностью к определенному типу повреждения. Так, например, урацил-ДНК-гликозилаза в высокой концентрации присутствует в тех клетках, в которых наиболее эффективно протекают процессы дезаминирования Cyt. Более того, клетки, утратившие данный фермент отличаются необычно высокой скоростью превращения пар G-C в пары А-Т. Характерная особенность урацил-ДНК-гликозилазы состоит в неспособности данного фермента удалять урацил (Ura) из РНК или тимин (Thy) из любой цепи ДНК. Вполне очевидно, что приобретенная клетками возможность отличать в составе ДНК Thy от продукта дезаминирования цитозина – Ura является необходимым условием не только селективного репарирования последнего, но и служит объяснением причины выбора эволюцией Thy в качестве одного из оснований ДНК вместо Ura.

В настоящее время установлено, что в бактериальных клетках присутствует только один вид урацил-ДНК-гликозилазы, в то время как клетки человека содержат, по меньшей мере, около четырех таких ферментов, обладающих различной специфичностью, что еще раз указывает на чрезвычайную значимость необходимости удаления урацилов из молекул ДНК. Наиболее широко распространенная урацил-ДНК-гликозилаза клеток человека, обозначаемая UNG, связана с реплисомой, в составе которой фермент удаляет случайно встроенные вместо Thy остатки Ura во время репликации. Установлено, что в одноцепочечных ДНК процесс дезаминирования Cyt протекает в 100 раз более эффективно, чем в двухцепочечных ДНК. Очевидно, по этой причине в клетках человека присутствует специфическая урацил-ДНК-гликозилаза hGMUG1, удаляющая все остатки Ura, которые могут случайно появиться в одноцепочечных участках ДНК во время репликации или транскрипции. Две другие урацил-ДНК-гликозилазы человека, TDG и MBD4, обеспечивают удаление остатков Ura или Thy образующихся в результате дезаминирования Cyt и 5^mCyt, соответственно, и оказавшихся спаренными с Gua.

Кроме урацил -ДНК-гликозилаз в клетках присутствуют другие ДНК-гликозилазы, которые узнают и удаляют поврежденные основания появляющиеся в составе ДНК в результате иных отличных от дезаминирования процессов. Примерами могут служить появление формамидопиримидина и 8-гидроксигуанина (которые образуются в результате окисления пуринов), гипоксантина (образующегося путем дезаминирования Ade) или алкилированных оснований, таких как 3-метил-Ade или 7-метил-Gua. ДНК-гликозилазы определенного типа способны также идентифицировать повреждения особого вида, что связано с образованием под действием УФ-излучения внутрицепочечных пиримидиновых димеров в молекуле ДНК. Следует также помнить, что АР-сайты могут появляться в ДНК в результате естественного процесса называемого апуринизацией.

На следующей стадии, как только в результате апуринизации или под действием любой из ДНК-гликозилаз образовался АР-сайт, в процесс репарации включаются АР-эндонуклеазы. Участие этих ферментов определяется невозможностью простого встраивания правильного основания в АР-сайт с последующим восстановлением N-гликозидной связи. Вместо этого из сахарофосфатного остова цепи ДНК вырезается остаток дезоксирибозо-5^/-фосфата и замещается новым нуклеотидом. Место расщепления цепи ДНК относительно положения АР-сайта (т.е. с 5^/- или 3^/-стороны) зависит от типа АР-эндонуклеазы. После расщепления происходит удаление сегмента ДНК содержащего АР-сайт, ДНК-полимераза I заполняет пробел и брешь сшивается ДНК-лигазой. Замены нуклеотидов в ДНК эукариот при этом виде репарации осуществляют специализированные ДНК-полимеразы (см. ниже).

Эксцизионная репарация нуклеотидов

Возникающие время от времени повреждения в ДНК, которые приводят к появлению заметных отклонений в естественной структуре двойной спирали данной информационной молекулы, исправляются с помощью ферментов системы эксцизионной репарации нуклеотидов. В этих случаях крупные олигомерные белки гидролизуют две фосфодиэфирные связи – по одной с каждой стороны обнаруженного искажения вызванного специфическим повреждением. Например, у E. coli и других прокариот такая ферментная система гидролизует пятую фосфодиэфирную связь на 3^/-стороне и восьмую фосфодиэфирную связь на 5^/-стороне повреждения, приводя к выщеплению одноцепочечного фрагмента ДНК длиной 12-13 нуклеотидов (длина фрагмента зависит от того – повреждено одно или два основания). В клетках человека и других эукариот подобная ферментная система обеспечивает гидролиз шестой фосфодиэфирной связи на 3^/-стороне и двадцать второй фосфодиэфирной связи на 5^/-стороне повреждения выщепляя фрагмент ДНК длиной 27-29 нуклеотидов. После расщепления двух фосфодиэфирных связей соответствующие олигонуклеотиды высвобождаются из дуплекса, а образующиеся пробелы заполняются с помощью ДНК-полимеразы I (у E. coli) или ДНК-полимеразы e (в клетках человека).

Ключевым ферментным комплексом системы эксцизионной репарации нуклеотидов у E. coli является нуклеаза АВС (называемая также АВС-эксцинуклеазой) включающая субъединицы трех видов – uvrA (мол. масса 104.000), uvrB (мол. масса 78.000) и uvrC (мол. масса 68.000). Термин эксцинуклеаза используется для того, чтобы подчеркнуть уникальные свойства данного ферментного комплекса способного катализировать две реакции специфического эндонуклеолитического расщепления, что отличает его стандартных клеточных эндонуклеаз. Для осуществления репарации комплекс белков uvrA и uvrB в соотношении А₂В сканирует ДНК и связывается с ней в сайте повреждения. Затем димер uvrA отделяется от этого комплекса, оставляя белок uvrB прочно связанным с ДНК. Дополнительное связывание белка uvrC с uvrB инициирует расщепление под действием uvrB пятой фосфодиэфирной связи на 3^/-стороне повреждения. Первое расщепление сопровождается uvrC-опосредованным расщеплением восьмой фосфодиэфирной связи на 5^/-стороне повреждения. Вырезанный таким способом одноцепочечный фрагмент размером 12-13 нуклеотидов выпетливается из дуплекса с помощью uvrD-геликазы. Описанный выше принцип репарации является основным способом удаления многих видов повреждений ДНК включая циклобутиловые (пиримидиновые) димеры, 6-4 фотопродукты (рис. 6), а также ряд аддуктов оснований таких как, например, бензо[ а ]пирен-гуанин. Источником бензо[ а ]пирена является сигаретный дым и множество продуктов питания приготовленных на углях.

Механизм действия эукариотических эксцинуклеаз в своей основе напоминает принцип функционирования бактериальных ферментов за исключением того, что для двойного разрезания поврежденной цепи у эукариот требуется участие 16 полипептидов абсолютно непохожих на субъединицы эксцинуклеаз E. coli. Как описано в главе 26 (Ленинджер), в некоторых случаях эксцизионная репарация нуклеотидов и эксцизионная репарация оснований у эукариот тесно связаны с процессом транскрипции. Известно также, что генетические дефекты компонентов системы эксцизионной репарации нуклеотидов у человека являются причиной развития целой серии тяжелых наследственных заболеваний.

Прямая репарация (обращение повреждений ДНК)

Репарация некоторых видов повреждений ДНК может происходить без предварительного удаления измененного основания или нуклеотида. Одним из наиболее полно изученных процессов прямой репарации является так называемая фотореактивация циклобутиловых пиримидиновых димеров, которая осуществляется с участием особого фермента ДНК-фотолиазы. Выше уже указывалось, что образование пиримидиновых димеров индуцируется УФ-светом, в свою очередь, ДНК-фотолиаза используя энергию поглощенного света, обеспечивает обращение данного повреждения (рис. 7). В большинстве случаев активность фотолиаз проявляется в присутствии двух кофакторов, которые выполняют функцию светопоглощающих агентов или, другими словами, хромофоров. Одним из таких хромофоров всегда является FADH^¯. Другой хромофор у E. coli и дрожжей представлен фолатом. Характерно, что ферменты фотолиазы не обнаружены у плацентарных животных, отсутствуют они и у человека.

Механизм реакции фотореактивации в целом включает образование свободных радикалов.

Еще одним примером репарации определенных видов повреждений ДНК, протекающей без предварительного удаления измененного основания или нуклеотида, является прямое исправление ошибок, возникающих в результате действия алкилирующих агентов. Под действием алкилирующих соединений наиболее часто подвергается модифицированию азотистое основание гуанин, енольная форма которого в присутствии, например, диметилсульфата или диметилнитрозамина превращается в О⁶-метилгуанин. О⁶-метилгуанин утрачивает способность спариваться с цитозином, но образует пару с тимином, что служит причиной транзиции G-C ® А-Т. Прямая репарация О⁶-метилгуанина осуществляется с участием О⁶-метилгуанин-ДНК-метилтрасферазы – фермента, который катализирует перенос метильной группы от О⁶-метилгуанина на сульфгидрильную группу одного из собственных остатков цистеина. Строго говоря, данная метилтрансфераза не является ферментом в общепринятом смысле этого слова, поскольку процесс метилирования одного из остатков цистеина этого белка неизбежно приводит к его полной инактивации. Таким образом, «расходование» целой молекулы белка с единственной целью – исправить одно поврежденное основание служит дополнительным доказательством приоритетности сохранения целостности ДНК.

Отличный от выше описанного, но в такой же степени прямой механизм используется для репарации 1-метиладенина и 3-метилцитозина. Аминогруппы остатков аденина и цитозина подвергаются метилированию реже, чем енольная форма гуанина, причем модифицируются эти основания, главным образом, в составе одно-цепочечных участков ДНК. Модификация аминогрупп остатков аденина и цитозина, также как и в случае О⁶-метилгуанина, приводит к изменению характера спаривания этих оснований. Известно, что у E. coli репарация 1-метиладенина и 3-метилцитозина осуществляется в ходе реакции окислительного деметилирования, катализируемой белком AlkB – a-кетоглутарат-Fe²⁺-зависимой диоксигеназой, являющимся представителем надсемейства диоксигеназ.

Специфические механизмы репарации ДНК

Процессы репарации ДНК, рассматривавшиеся до этого момента, касались исправления ошибок в составе двухцепочечной ДНК, где неповрежденная цепь предоставляет верную генетическую информацию для правильного исправления другой – поврежденной цепи. Однако при некоторых типах повреждений, таких как двухцепочечные разрывы, межцепочечные сшивки или при повреждениях одноцепочечной ДНК (как, например, в случае генома фага jХ174), комплементарная цепь сама оказывается поврежденной или вообще отсутствует. Чаще всего двухцепочечные разрывы или повреждения в одноцепочечной ДНК возникают тогда, когда движущаяся репликативная вилка наталкивается на не исправленное по какой-либо причине повреждение в ДНК. Подобного рода повреждения, а также образование межцепочечных сшивок могут также возникать в результате действия ионизирующего излучения на генетический материал клетки или в ходе реакций окисления структурных компонентов ДНК.

В настоящее время установлено, что бактериальные клетки в случае «застревания» или временной остановки репликативной вилки в каком-либо участке ДНК, содержащем не исправленное повреждение, используют два способа репарации.

Первый способ, при отсутствии второй (комплементарной) цепи необходимой для точной репарации, связан с возможностью предоставления генетической информации, источником которой является отдельная гомологичная хромосома. Из этого следует, что в данном случае система репарации зависит от общей гомологической рекомбинации. Более детально процесс такой рекомбинационной репарации будет рассматриваться позже.

В некоторых условиях используется второй путь репарации, который называют независимым от повреждения синтезом ДНК (error-prone translesion DNA synthesis) (TLS). При активации данного способа исправления ошибок, процесс репарации ДНК становится значительно менее точным и сохраняется высокая вероятность мутирования. У бактерий TLS-репарация является частью общего механизма ответа клетки на обширные повреждения ДНК, вызванные различными химическими или физическими факторами. Этот общий механизм весьма удачно назван SOS-ответом. Некоторые белки участвующие в SOS-ответе, такие как уже упоминавшиеся ранее uvrA и uvrB, в норме всегда присутствуют в клетке, однако их уровень резко возрастает при серьезных повреждениях ДНК и, соответственно, в результате активации процесса SOS-репарации. В TLS-репарации ДНК дополнительно принимают участие специфические SOS-белки, известные как UmuC и UmuD (о важной роли белков UmuC и UmuD говорит тот факт, что инактивация генов umu приводит к полному нарушению процесса TLS-репарации).

Белок UmuD в ходе SOS-регулируемого процесса подвергается специфическому протеолитическому расщеплению с образованием своей укороченной формы UmuD^/. Впоследствии укороченная форма UmuD^/ образует с белком UmuC комплекс, который представляет собой специализированную ДНК-полимеразу, известную как ДНК-полимераза V. Эта ДНК-полимераза способна реплицировать такие поврежденные участки в ДНК, на которых в норме репликативная вилка «застревала бы» или делала временную остановку. Поскольку в таких случаях правильного спаривания оснований в сайтах повреждения не происходит, подобная репликация сама по себе несет множество ошибок (error-prone).

Может показаться, на первый взгляд, что существование и функционирование системы репарации включающей ДНК-полимеразу V, которая только увеличивает частоту мутаций, не соответствует целям сохранности генетической информации. Более того, можно думать, что такая система репарации включается в момент полной безысходности для жизни клетки. Однако не все так просто. Гены, ответственные за синтез белков UmuD и UmuC активируются только на поздних этапах SOS-ответа и они абсолютно не активны в тех случаях, когда повреждения ДНК не являются настолько масштабными, что продвижение репликативной вилки постоянно блокируется. Накопление мутаций, вызванное функционированием ДНК-полимеразы V, убивает одни клетки и создает большую опасность для жизни других, но такова биологическая цена для многоклеточного организма, которую он платит за преодоление «непреодолимого» барьера для репликации, поскольку при этом создаются условия для выживания, по крайней мере, части мутантных клеток.

Функционирование ДНК-полимеразы V зависит от участия некоторых других важных белков клетки, таких как белка RecA, SSB-белков, а также некоторых субъединиц ДНК-полимеразы III. Еще одна ДНК-полимераза – ДНК-полимераза IV также индуцируется в ходе SOS-ответа. Процесс репликации, осуществляемый ДНК-полимеразой IV (продуктом гена DinB), как и в случае ДНК-полимеразы V также сопровождается сохранением ошибок в ДНК. В целом бактериальные ДНК-полимеразы IV и V являются представителями семейства TLS-полимераз обнаруживаемых и в клетках других организмов. Эти ферменты в ходе эволюции утратили корректирующую 3^/-экзонуклеазную активность, что снижает точность (селективность) выбора соответствующего нуклеотида при репликации ДНК с участием этих ДНК-полимераз на величину, составляющую 10². Другими словами точность репликации с участием ДНК-полимераз IV и V уменьшается до 1 ошибки на ~1000 нуклеотидов.

У млекопитающих также обнаружено множество ДНК-полимераз семейства TLS, отличающихся низкой точностью копирования. Однако функционирование этих ферментов не является вредоносным для клетки, поскольку они принимают участие только в процессах репарации ДНК. Например, ДНК-полимераза h (эта), обнаруженная у всех эукариот, принадлежит к семейству TLS-полимераз. Этот фермент обеспечивает репликацию ДНК, не принимая во внимание присутствия в одной из матричных цепей циклобутилового димера (т.е. пиримидинового димера). В этом случае может даже происходить встраивание двух адениновых нуклеотидов комплементарных циклобутиловому димеру. Некоторые другие, не корректирующие ДНК-полимеразы, такие как ДНК-полимеразы b, i (йота) и l принимают участие в специфических реакциях эксцизионной репарации оснований у эукариот. Интересно, что каждый из этих ферментов обладает необычной 5^/-дезоксифосфат-лиазной активностью в дополнение к своей обычной полимеразной активности. После удаления неправильного основания под действием гликозилазы и последующего расщепления сахарофосфатного остова с участием АР-эндонуклеазы эти ферменты удаляют 5^/-дезоксифосфатную группу в сайте лишенном основания и заполняют этот небольшой пробел за счет своей полимеразной активности. Частота возникновения мутаций обусловленная действием ДНК-полимеразы h сводится к минимуму из-за небольшой протяженности участка (часто всего в один нуклеотид) псевдорепарирования с участием этого фермента.