Читайте также:
|
Для диагностики инфекционных заболеваний генетическими методами маркером возбудителя является его геном. Методы индикации нуклеиновых кислот применяют для диагностики вирусных инфекций, для идентификации бактерий (особенно таких, которые трудно выделить) и для определения точного таксономического положения микроорганизмов. Методы позволяют обнаружить микроорганизм в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию ДНК без его выделения в чистую культуру.
Метод молекулярной гибридизации основан на способности ДНК и РНК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными олигонуклеотидными фрагментами, искусственно синтезированными и меченными ферментом, флюорохромом или изотопом. Эти фрагменты называются зондами.
Для проведения молекулярной гибридизации молекулу исследуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий меченый зонд (рис. 4). Создаются условия, благоприятные образованию двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль. После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса при помощи соответствующей метки.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном увеличении числа копий (амплификации) определенного участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой (рис. 5). ПЦР - это очень чувствительный метод, теоретически для получения результата достаточно наличие в материале одной молекулы ДНК.
ПЦР состоит из трех основных этапов: подготовки исследуемой пробы (изоляция ДНК или РНК), собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которая затем используется в качестве матрицы в ПЦР. После того, как из бактерий Thermous thermophilis удалось получить ДНК-полимеразу, которая наряду с полимеразной обладает еще и обратно-транскриптазной активностью, удалось совместить эти две реакции. Этот вариант ПЦР широко применяется для детекции РНК-содержащих вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.
Для проведения ПЦР необходимы пять основных компонентов: 1)фермент ДНК-полимераза; 2)пара олигонуклеотидных праймеров; 3)набор нуклеотидов; 4)копируемая ДНК; 5)ионы Mg +2, необходимые для функционирования ДНК-полимеразы.
Для амплификации (т.е. синтеза ДНК-матрицы) отбирают наиболее консервативную часть, уникальный ген. Для запуска синтеза на ДНК-матрице используют 2 праймера (короткие, длиной 20-30 оснований одноцепочечные фрагменты ДНК), комплементарные 3 ¢ -концам ДНК искомого гена. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют праймеры, затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками (отжиг). Добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. При температуре, оптимальной для функционирования ДНК-полимеразы, нуклеотиды присоединяются к 3' -концам праймеров, формируется специфический фрагмент (ампликон). После этого цикл повторяют снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз в 2 раза. Рассчитано, что за 30-40 циклов из одной матрицы можно получить 10 8 ампликонов. Реакцию проводят в специальных приборах - амплификаторах. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом гель-электрофореза и визуализацию в УФ свете после окрашивания этидием бромида. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю можно провести ДНК-гибридизацию.
Параграфы на тему „Генетика микроорганизмов“:
— Конъюгация микроорганизмов
В 1946 г. Дж. Ледерберг и Э. Татум описали феномен конъюгации — передачи генетического материала из клетки в клетку при непосредственном контакте бактерий. Исследования проводились на штамме Е. coli К12. Перенос генетического материала происходил толь1 ко в одном направлении; одна клетка являлась донором, другая — реципиентом.
— Трансформация микроорганизмов
Трансформация (от transformatio — преобразование) изменение свойств бактериальной клетки в результаате процесса переноса информации, при котором фрагмент ДНК клеткидонора проникает в родственную бактерию.
— Рекомбинация у бактерий
У бактерий, так же как при изучении генетики высших организмов, принято выделять понятия: генотип, фенотип, модификаци
— Трансдукция микроорганизмов
Осуществление переноса генетического материала от клетки донора к бактерииреципиенту с помощью фага получило название трансдукции. Траисдуцирующий фаг переносит фрагмент ДНК из предыдущего хозяина и вводит эту ДНК таким же образом, как и свою собственную молекулу ДНК, в чувствительную к нему бактериальную клетку.
— Плазмиды микроорганизмов
Кроме хромосомы, у некоторых бактерий обнаруживаются дополнительные внехромосомные генетические детерминанты, получившие название плазмид. К настоящему времени обнаружено большое разнообразие плазмид, среди которых наиболее изученными являются половой фактор (F), фактор множественной лекарственной устойчивости (R), факторы бактериоциногений (Col), плазмиды, контролирующие у Е. coli синтез энтеротоксина (Ent), обеспечивающие продукцию гемолизина (Н1у), детерминирующие синтез поверхностных антигенов (К88, К99) и др.
— Что такое генетика. ДНК.
Генетика — наука о наследственности и изменчивости. Наследственность характеризует сохранение постоянства свойств вида в поколении, т. е. воспроизведение себе подобных. Изменчивость — различия в свойствах между особями одного вида.
— Мутация
Под мутацией (от mutatio — изменение) подразумеваются стабильные наследуемые изменения в генотипе, проявляющиеся фенотинически в виде измененного признака. Основу мутации составляют качественные или количественные изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, которые могут возникать при жизнедеятельности бактерий под влиянием эндогенных факторов или при действии химических и физических мутагенов.
Дата добавления: 2014-12-18; просмотров: 126 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |