Читайте также:
|
Одним из наиболее впечатляющих примеров использования FISH для выявления или уточнения определенных хромосомных патологий является использование ДНК-проб для обнаружения микроделеций хромосомных районов, приводящих к различным патологиям развития. Для этого применяются клонированные уникальные последовательности ДНК, локализованные в районе, потеря которого приводит к развитию синдрома. Это ДНК-пробы, созданные для детекции определенных локусов, мы будем использовать термин — идентификатор специфичных хромосомных локусов (locus specific identificator — LSI). Пробы специфичны для определенных хромосомных участков, представленных одной копией на гаплоидный геном. Их последовательности клонированы в различных векторах (трансгенные бактериальные штаммы, плазмиды, космиды, и др.), так что их размеры могут варьировать в широких пределах – от нескольких тысяч до 2 млн. и более пар нуклеотидов. Применение этих зондов особенно показано для точной идентификации структурных перестроек – сайтов разрывов хромосом при транслокациях, инверсиях, делециях, инсерциях и др.
К этой группе ДНК-проб примыкает класс субтеломерных зондов – SubTel пробы.
К SubTel пробам относят теломерные ДНК, которые содержат последовательности ДНК, специфичные для субтеломерных и теломерных участков хромосом. Эти ДНК-пробы позволяют эффективно выявлять интерстициальные, субтеломерные или теломерные делеции или дупликации, а также маркировать индивидуальные хромосомы при проведении FISH диагностики.
Особого внимания заслуживает молекулярно-цитогенетическая диагностика субтеломерных хромосомных микроаберраций. Частота данных хромосомных аномалий может достигать 5—25% в группах детей с недифференцированными формами умственной отсталости. Однако в связи с тем, что применение этого метода сопряжено с большими финансовыми затратами, диагностика субтеломерных хромосомных микроаберраций в настоящее время используется редко.
Альтернативным методом диагностики субтеломерных хромосомных микроаберраций, предложенным отечественными исследователями, является использование FISH и ДНК-зондов, маркирующих субтеломерные участки хромосом. В настоящее время известны многие клинические характеристики пациентов с субтеломерными микроаберрациями различных хромосом. Благодаря этому становится возможным теоретически выделить ту хромосому, в которой с наибольшей вероятностью расположена микроаберрация, в результате исчезает необходимость одновременного использования нескольких зондов и анализ производится с использованием лишь одной субтеломерной ДНК-пробы.
Цельно-хромосомные зонды или зонды полного окрашивания хромосом WCP-пробы – зонды для полного окрашивания или цельнохромосомные зонды представляют собой набор уникальных последовательностей ДНК, равномерно распределенных вдоль всей длины определенной хромосомы. Такие зонды (в литературе введено другое их название - painting-пробы) используются только на метафазных хромосомах и их применение высоко эффективно в идентификации маркерных хромосом и сложных структурных перестроек с вовлечением нескольких хромосом. Однако не дают возможность регистрировать внутрихромосомные перестройки. С помощью гибридизации наборов хромосомоспецифических проб, меченных разными красителями, в различных сочетаниях на препарате можно получить спектральный отпечаток для каждой хромосомы. Для идентификации всех хромосом набора достаточно 5 флуоресцентных красителей.
Создание WCP ДНК-проб стало возможным в результате разработки метода выделения ДНК индивидуальных хромосом (микродиссекции), который представляет собой "вырезание" целой хромосомы или какого-либо ее специфического участка in situ. Суть метода заключается в том, что из метафазных хромосом под микроскопом вырезают интересующий участок, который затем клонируют, получая специфическую для данного района библиотеку. В ДНК микродиссектированной хромосомы (или участка) вводится флюоресцентная метка, за счет чего появляется возможность создания коллекций WCP ДНК-проб или ДНК-проб, маркирующих определенные участки хромосом. Таким образом, микродиссекция является достаточно быстрым и эффективным методом получения библиотек, специфичных для определенных хромосомных участков.
Дата добавления: 2015-02-16; просмотров: 133 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |