Задания для СДС во внеучебное время.

Выше изложенные тесты и ситуационные задачи.

При решении заданий при самоподготовке использовать Приложения.

Приложение № 1

Классификация семейства Vibrionaceae

Род Aeromonas

Род Plesiomonas

Род Photobacterium

Род Vibrio

Род Vibrio

а) Вид V.cholerae 01 (2 биовара: классический и Эль-Тор)

б) Вид V.cholerae не 01 (от 02 до 0139, НАГ, RО)

в) Виды: V.metschnikovii V.vulnificus

V.harveyi V.marinus

V.parahaemolyticus V.minicus

V.alginolyticus и другие – всего 34 вида.

Возбудителями холеры являются вибрионы 01 и 0139 групп.

Остальные вибрионы вызывают острые кишечные инфекции типа гастроэнтеритов и раневые инфекции, отдельные виды – например, V.vulnificus, - септицемии, раневые инфекции, пневмонии, эндометриты, V.alginolyticus - ОКИ, отиты, раневые инфекции.

Приложение № 2

Основные дифференциальные признаки возбудителей холеры

Реакция Фогес-Проскауэра: В среду Кларка засеваем культуру, затем добавляем креатинин (альфа-нафтол с КОН) – в положительном случае бульон окрашивается в розовый цвет.

Среда Кларка: МПБ + 1 % глюкозы + К₂НРО₄. При ферментации глюкозофосфатного бульона Кларка (глюкозы) микробами образуется ацетилметилкарбинол (ацетоны), окрашивающий среду в красный цвет при взаимодействии с креатинином (альфа-нафтол с едким калием).

Тест на оксидазную активность: Оксидаза окисляет фенилендиамин,

что приводит к появлению синего окрашивания. 1 каплю 1% раствора параминодиметиланилина (гидрохлорида или оксалата) наносят на поверхность 18-часовой агаровой культуры в чашке Петри + 1 каплю 1% спиртового раствора альфа-нафтола. В положительных случаях через 1-3 минуты получаем синее окрашивание.

Гексаминовый тест: Берем глюкозо-гексаминовую среду 1% раствор гексамина (уротропина) в 100 мл МПБ + 1% глюкозы + индикатор бромтимоловый синий (исходный цвет среды зеленоватый) + засеваем культуру. Вибрион Эль-Тор через 6-8 часов окрашивает среду в желтый цвет, истинный холерный вибрион цвет среды не изменяет.

Приложение № 3

Развернутая дифференциальная характеристика

холерных 01 и основных видов холерных не 01 вибрионов

Приложение № 4

Чувствительность холерных вибрионов и 0139 к антибактериальным препаратам

Асплоксацин

Офлоксацин

Цефотаксин

Ципрофлоксацин

Гентамицин

Левомицитин

Рафампецитин

Доксициклин

Тетрациклин

Стрептомицин

Ампициллин

Фуразомидон %

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Приложение № 5

СХЕМА

бактериологического исследования (начальный этап)

Материал

1.Рвотные массы 4.Кровь 6.Отделяемое ран

2.Промывные воды желудка (дефибриниров.)

3.Испражнения 5.Спинномозговая жидкость

1-2г или мл

первая среда

обогащения 1 мл

50 мл 1% п.в. Э.С.

Щ.А.М. с 1,5% NaCl

1-й день через 6-8 часов через 6-8 часов

исследования инкубации при инкубации при

37^оС 9 мл 37^оС п.в.

МПБ с с 1,5%

1,5% NaCl NaCl

Э.С.

вторая среда

обогащения

10 мл 1% п.в. Щ.А.М.

Щ.А.М. Щ.А.М.

вторая среда

обогащения

1% п.в. с

1,5% NaCl

__________________________________________________________________

1-й день 1. Посев на щелочной агар (Щ.А.М.) и на одну элективную среду

(Э.С.)

2-й день 2. Отбор колоний, подозрительных на вибрионы с посевов

предыдущего дня:

а) подозрительные на холерные вибрионы колонии агглютинируют холерными 01, RО и 0139 сыворотками; при

положительных результатах проводят исследования, направленные на выделение и идентификацию возбудителя холеры.

б) подозрительные на холерные не 01 группы и др.виды вибрионов колонии на щелочном агаре и элективной среде отсеивают одной петлей на среду Ресселя и в 1% пептоновую воду без NaCl и с 5-10 % NaCl.

3-й день 1. Изучение посевов со 2-го пептона и выделение подозрительных

колоний (культур) проводят так же, как и с 1-го пептона.

2. Учет роста культур в 1% пептонной воде без NaСl и на среде

Ресселя.

3. Постановка пробы на индофенолоксидазу с культурой со среды Ресселя и реакция агглютинации с холерным 01 и 0139 сыворотками на стекле с культурами, выросшими в 1% п.в. без NaCl и давшие характерные изменения на среде Ресселя.

4. Изучение морфологии клеток в мазках, окрашенных по Граму.

5. Посев отобранных культур (галофильных вибрионов) в дифференциально-диагностические среды, содержащие 1,5% NaCl.

6. Определение чувствительности культур к вибриостатику 0/129.

4-й день 1. Учет результатов тестов идентификации. Определение вида выделенных культур вибрионов.

2. Идентификация культур, выделенных со второго пептона.

5-й день Учет результатов исследования. Выдача ответа (окончательного).

__________________________________________________________________

Примечание: в связи с высокой энергией роста холерных вибрионов учет результатов на каждом этапе проводят несколько раз, через 4-8 часов.

Приложение № 6

Ускоренный метод диагностики холеры

Вид: Микроскопическое изучение Кал, рвотные массы, желчь,

(рисового отвара)

I этап:

Грам «-» вибрионы Раздавленная капля Иммунофлюоресценция

Подвижность РИФ, РНИФ

Посев на комплект сред:

Б/фаг

Мукарджи IV

Пептон 1% пепт. 1% пепт. 5% кров. Щелочной МПА с

1% вода вода + вода + МПА с дисками антибиотиков

01 сывор. 0,5% эритроцитами (полимиксин) и б/фагом

крахмала барана

II этап: Учет по принципу I этапа каждые 4-6 часов в течение суток.

Пленчатый рост Агглютинат 01 При добавлении Гемолиз Индивид. рез-ты

Грам «-» вибрион вибриона йода: V.eltor Х.в. – чувств к

Подвижны Нет его – при Нет синевы при Нет его - полимиксину и

не 01 вибрионах х.в. 01 холерный б/фагу;

Синева – при вибрион Эль-Тор – нет

вибр. Эль-Тор.

За сутки этим методом можно получить окончательные результаты

Приложение № 7

Экспресс-методы диагностики вибрионов

1. Люминесцентно-серологический (РИФ, РНИФ).

2. Иммобилизация вибрионов типовыми сыворотками.

3. Иммобилизация вибрионов типовыми бактериофагами.

4. Развернутая реакция агглютинации в бульоне.

5. Метод микроагглютинации материала.

6. Выявление вибрионов в воде реакцией агглютинации.

7. Исследование воды путем подращивания на мембранных фильтрах с помощью люминесцентной микроскопии.

Особенности иммуно-люминисцентной диагностики холеры –

РИФ и РНИФ

РИФ – реакция прямой иммуно-флюоресценции при холере ставится по классической методике путем микроскопического выявления возбудителя в зафиксированном и обработанном ФИТЦ – препаратом мазке. Эта особенность (обязательная фиксация) связана с эпидемической опасностью работы с ООИ.

РНИФ – непрямая реакция иммунофлюоресценции ставится в случае отсутствия меченой ФИТЦ противохолерной иммунной сыворотки, но при наличии специфической не меченой и меченой противоиммуноглобулиновой видовой к белкам того вида животного, который использован для получения иммунных противохолерных антител. Эта реакция разработана Кунсом. Она выявляет антитела к Ig в иммунной сыворотке, среагировавшие в мазке с возбудителем.

Приложение № 8

Питательные среды

I. Жидкие среды обогащения:

1. 1% пептонная вода.

2. Пептонная вода с теллуритом калия.

II. Плотные среды:

1. Щелочной агар (рН = 8-8,2).

2. Щелочной агар с теллуритом калия.

3. Желточно-солевой агар (ЖАС).

4. Среда Дьедонне (щелочной МПА с дефибринированной кровью быка или барана).

5. Среда Монсура (таурохолат-теллуритовая).

6. Среда Аронсона (щелочной агар с сахарозой, сернокислым натрием, фуксином). Холерные вибрионы дают розовые колонии.

7. Среда Оттоленги (щелочной МПБ с бычьей желчью).

8. Теллурит-калиевая среда.

9. Висмут-сульфитная среда Рида.

10. Висмут-сульфитная среда с маннозой Вильсона и Рейли, рН-8,8.

III. Косервирующие среды:

1. Среда Венкатрамена и Рамакришнона (щелочной бульон с морской солью).

2. 2% раствор поваренной соли (морская соль).

3. 1% пептонная вода.

Приложение № 9

Фаготипирование холерными диагностическими бактериофагами ХДФ холерных вибрионов Эль-Тор с одновременной дифференциацией их патогенности

Примечание: ХДФ – холерный диагностический фаг.

Приложение № 10

Фаготипирование энтеротоксигенных неагглютинирующих вибрионов (НАГ) не 01 группы типовыми бактериями ТЭПВ к энтеропатогенным вибрионам

Примечание: ТЭПВ – типовые фаги к энтеропатогенным вибрионам НАГ. Типируют методом агаровых слоев.

Методика: испытыемую культуру засевают в пробирку с 4 мл МПБ, инкубируют при + 37^о С в течение 3 часов. Затем 0,3 мл бульонной культуры вносят в пробирку с 4 мл. 0,7% расплавленного и остуженного до + 45^оС МПА, перемешивают и выливают вторым тонким слоем в стерильную чашку с первым застывшим слоем 2% МПА, после этого на поверхность МПА петлей или каплей из пипетки наносят типовые бактериофаги в цельном виде, а при необходимости – в разведении от 10^-1 до 10^-4. Каплям фага дают подсохнуть, впитаться, после чего пробы помещают в термостат при +37^оС на 4-18 часов. Контроль – физ.раствор.

Учет результатов ведут при наличии стерильных пятен в связи с лизисом чувствительных к фагу культур. В контроле и при нечувствительности культуры лизиса нет.

Ускоренный метод. Из подготовленной бульонной культуры делают штриховой высев на 8 секторов МПА, а сверху наносят бактериофаг. Режим инкубации и учет результатов те же.

Приложение № 11

Характеристика генетической основы патогенности

Приложение № 12

Галофильные вибрионы

К патогенным для человека вибрионам, кроме возбудителей холеры, относятся морские галофильные вибрионы, вызывающие пищевые отравления, связанные с употреблением в пищу продуктов моря, холеро- и дизентериеподобные заболевания, септицемии, раневые инфекции.

К ним относятся: V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.vulnificus, V.minicus и др. Они инфицируют человека алиментарно-энтеральным и контактным (с морской водой) путями.

Основные свойства некоторых морских галофильных и не галофильных вибрионов, патогенных для человека

7.5. Источники информации:

Список рекомендуемой литературы:

Основная:

1. Лекции

2. Методическая разработка

3. Борисов Л.Б. с соавт. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. - М., 2002.

4. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /Под ред. Л.Б. Борисова, А.М. Смирновой. - М., 2008.

5. Микробиология, вирусология иммунология/ под ред. В.Н. Царева.- М., 2009. – 543с.

6. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов.- 3-е изд.- СПб.: СпецЛит, 2008.

7. Поздеев О.К. Медицинская микробиология: учебное пособие (под ред. Покровского В.И. - 4 изд.). М., 2008.

Рекомендуемая литература

1. Атлас-руководство по микробиологии, иммунологии и вирусологии/ под ред. Академика РАМН, проф. А.А. Воробьева и проф. А.С. Быкова.- М.: МИА. – 2003, 2005. – 563с.

2. Справочник по микробиологическим, вирусологическим методам исследования под ред. М.О. Биргера. -М., 1982. - С.363-381.

3.Бардых И.Д. Эксперементальна оценка эффективности лактобацилл для профилактики и лечения холеры // Журн. Микробиологии, 2001.№2.С.68-71.

4.Зиатдинов В.Б.Особенности эпидемиологии современной холеры// Журн. Микробиологии, 2000.№5.С.87-91.

5.КирьяковаЛ.С.,Хайтович А.Б.Холера как внутрибольничная инфекция //Эпидемиология и инфекционные болезни,2003.№5.С.48-51.

6.Поль де Крюи. Охотники за микробами. М:Наука, 1987.

7.Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Кутырев В.В. Генетические маркеры эпидемических штаммов Vibrio choerae (обзор) //Журн. Микробиологии,2000.№5.С.87-91.

8. Смирнова Н.Н.,Кокушкин А.М. Эпидемически значимые штаммы холерного вибриона: генетические особенности и возникновение // Эпидемиология инфекционных болезней, 2000. №3. С.25-29.