Читайте также:
|
|
ПЦР РВ Pos | ПЦР РВ Neg | |
ИФА Pos | ||
ИФА Neg |
ОБСУЖДЕНИЕ
Методы обнаружения в диагностических пробах ДНК или РНК, специфичных для инфекционных патогенов, приобрели большое значение в медицине и ветеринарии. Несмотря на разнообразие технологий молекулярной диагностики, во всех случаях материал для исследования - нуклеиновые кислоты – должен быть выделен из биопроб и очищен от интерферирующих примесей. В данной статье описан лабораторный прототип набора для выделения ДНК из цельной стабилизированной крови.
Описанный в данной статье метод выделения ДНК использует обратимую адсорбцию ДНК на специально подготовленный сорбент с последующей элюцией ДНК в буфер с низкой ионной силой. Метод хорошо описан в научной литературе и патентах [20] [21] [22] [23] . Для выделения ДНК по указанному методу можно применять готовые наборы, которые выпускают большое количество производителей (Qiagen, Promega, Millipore, Sigma и др.). Компании-производители не раскрывают своих ноу-хау и, с учётом немалой цены наборов на отечественном рынке, это создаёт неудобства для отечественных ветеринаров, медиков и биологов. В данной статье описаны химические составы и протоколы приготовления всех компонентов лабораторного прототипа набора для выделения ДНК методом адсорбции-элюции. Приведены выход и чистота выделенных нами ДНК, которые полностью соответствуют характеристикам препаратов, получаемых с помощью коммерческих наборов производства Promega.
Высокое качество ДНК достигается за счёт:
1. очистки проб от гемоглобина путём лизиса эритроцитов и отделения лейкоцитарной массы;
2. лизиса ядросодержащих клеток в растворе, содержащем детергент и т.н. хаотропный агент;
3. адсорбции ДНК на сорбент с высокой ёмкостью по отношению к ДНК (800-1000 нг/мг);
4. использования нескольких последовательных отмывок сорбента, связанного с ДНК, буферами с убывающей ионной силой.
Хаотропные агенты разрушают макромолекулярные структуры высокого порядка (третичные структуры белков), солюбилизируют клеточные мембраны, но не денатурируют ДНК и РНК. Авторы опубликованных в литературе протоколов используют разные хаотропные агенты, предпочтительно применяются гуанидина тиоционат (GuaSCN) или гуанидина гидрохлорид (GuaHCl), рекомендуемый диапазон рабочих концентраций которых от 1M до 4M для GuaSCN и 6-8M для GuaHCl. В ряде источников описано использование перхлората натрия (NaClO4), иодидов натрия или калия (NaJ, KJ) в рабочей концентрации 4M [20] [21] [22] 23].
Нуклеиновые кислоты обладают природной способностью в присутствии хаотропных солей адсорбироваться из раствора обратимым образом на поверхность кристаллических материалов с определённой периодической структурой поверхности [22] . Силикагель (кремнезём, SiO2), мелкодисперсное стекло, кварц, диатомовая земля или цеолиты являются примерами таких материалов. Способность хаотропных солей облегчать селективную адсорбцию ДНК происходит по причине того, что в высоких концентрациях они снижают растворимость полярных соединений (например, нуклеиновых кислот), но повышают растворимость в воде неполярных веществ и макромолекул, имеющих гидрофобные участки (например, белков) [24] . В водных растворах макромолекулы окружены упорядоченными молекулярными структурами, состоящими из ориентированных молекул воды, т.н. гидратными оболочками. Стабильность гидратных оболочек обеспечена водородными связями между молекулами воды. Именно наличие гидратных оболочек приводит к растворимости ДНК в воде. Когда в растворе в высоких концентрациях (>2M) присутствуют хаотропные ионы, молекул воды становится недостаточно, чтобы полностью их сольватировать. Это приводит к росту роли ион-дипольных взаимодействий между гидратированными ионами и снижению роли водородных связей, гидратные оболочки вокруг молекул ДНК разупорядочиваются, ДНК становится доступной для взаимодействия с гидрофобной поверхностью кремнезема [24] .
Отмывка сорбента, несущего адсорбированную на нём ДНК, заключается в ресуспендировании в буфере с ионной силой, пониженной по сравнению с условиями оптимальной адсорбции. Это приводит к диссоциации с сорбента контаминирующих примесей, способных лишь к неспецифическому связыванию с силикагелем (белки, гликопротеины крови). Присутствие в отмывочных буферах органических растворителей (этанол или изопропанол) удерживает ДНК в адсорбированном состоянии.
Количественная элюция ДНК с сорбента происходит на последней стадии протокола в буфер с очень низкой ионной силой (10 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА) при нагревании (50-65°С).
Инфекция ВЛКРС обыкновенно протекает с длительным периодом бессимптомного и субклинического течения, что делает незаменимым применение методов лабораторной диагностики для раннего выявления больных животных. В настоящее время лабораторным тестом, на который опирается система профилактических мероприятий, является РИД (AGID). РИД чрезвычайно прост в постановке, но значительно уступает в чувствительности более современным методам иммуноанализа, таким как ИФА и иммуноблот [24] . Невозможность автоматизации делает РИД не очень удобной реакцией при массовых исследованиях. Наиболее чувствительным тестом для подтверждения диагноза после истечения острого периода вирусной инфекции, как у животных, так и у человека, является ИФА. В скрининговых эпизоотологических исследованиях чувствительность ИФА для выявления случаев инфекций КРС варьирует от 60 до 80% [25] . Все животные-вирусоносители в стаде в исследованиях поперечного формата (т.е. с однократным тестированием), обыкновенно, не выявляются ни одним серологическим методом. В системе профилактических мероприятий ПЦР пока занимает нишу высокоспецифичного метода, пригодного для использования в качестве подтверждающего теста. Расширение перспектив использования ПЦР связано с ранней диагностикой и с тем обстоятельством, что телята, которых выкармливали молозивом или молоком от серопозитивных коров, обычно приобретают материнские антитела. Для выявления зараженных телят в период действия колострального иммунитета наиболее предпочтительным методом является ПЦР. По литературным данным, эффективность ПЦР в скрининговых исследованиях поголовья сравнима с эффективностью ИФА (выявление до 80% больных животных при однократном обследовании) [24] . Таким образом, для максимального выявления всех инфицированных BJIKPC животных необходимо комбинированное использование серологических и молекулярных методов.
Чувствительность ПЦР в режиме реального времени определяется, прежде всего, подбором и дизайном эффективных праймеров и зондов. По нашим данным, на имеющейся панели образцов (n=112) специфичность ПЦР-РВ составила 100%, тогда как чувствительность - только 80%. Данное наблюдение может свидетельствовать в пользу циркуляции в обследованном стаде и, возможно, на территории нашей страны, изолятов ВЛКРС, отличающихся по последовательностям генома от прототипных изолятов из базы Genbank, использованных при расчётах праймеров и зондов. У авторов данной статьи не было финансовых ресурсов для того, чтобы исследовать последовательности генома казахстанских изолятов ВЛКРС. Однако данная работа однажды должна быть выполнена, как для адаптации диагностических тестов к местным изолятам, так и для доказательного описания циркуляции возбудителя посредством молекулярно-эпизоотологических подходов.
Необходимость улучшения материальной базы и уровня оснащённости ветеринарной службы делает актуальными создание и апробацию прототипов наборов для ПЦР, производимых или по зарубежной лицензии, или с использованием технологий, разработанных в стране.
ТҮЙІН
Энзоотикалық лейкоз ІҚМ-дамыған және дамып келе жатқан елдерде, сонын ішінде Қазақстан елінде соңғы он жылдықта бірінші орында тұрақты болып тұрған,өнімді мал басы арасында кең таралған ірі қараның инфекциялы ауруы. ҚР ветеринариялы қызметтердің көрсеткіші бойынша, қазіргі таңда өнімді мал басы арасында лейкоз маркерларының кездесуі жоғарланып келеді,сондықтан профилактикалық шараларды кушейту және де AGID, ИФТ және ПТР ұсынылған әдістерді қолдана отырып шаруашылықты диагностикалық заттармен қамтамасыз ету керек. Мұндай тест-системалар отандық тауаларда импотрты немесе импорттілеу компонентеринде Қазақстанда жинақталған. Компонентті ветеринария ушін жасалған прототивті тест-систеаларды отандық технологиялық базада өндеу маңызды.
Мақалада ПТР диагностикасында зерттеуде сиыр қанандагы ДНҚ-да бөлініп алынатын әдіс көрсетілген. Қандағы ДНҚ бөліп алуда зертханалық прототипті жиынды, барлық компоненттерди дайындау хаттамалары және химиялық құрамдар жасалынды.
ІҚМ лейкоз вирусты инфекциясының диагностикасы үшін индикация нәтижесінде нақты уақытта (ПТР-РВ) ПТР тест-системасы өнделді.Жиында праймерлер тізбегі,зондылары және ПТР-РВ оптималды реакциялы усынысы көрсетілген. ПТР-РВ тест-системасының зертханалық прототипті инфекцияланған жануарлардың ДНҚ-да болатын провирусты анықтауға және тестің орындауының сапасын бақылауын қолайшлы етеді, сиырдын геномының тізбектелуіне негізделген ішкі сапа амплификациясы бар.Асыл тұқымды шаруашылықтардан ересек сиырлардан алынған (n=112) үлгі жинақтасын зерттеуде ИФТ және ПТР-РВ нәтижелері 89% сәйкестік болды, сонымен бірге ИФТ коммерциялық қолжетімді «алтын стандарт» ретінде тест-система, сезімталдығы және телімділігі ПТР-РВ мен 80 және 100%,сәйкесінше.
SUMMARY
Enzootic bovine leukemia is an infectious disease of cattle, which holds the first place in prevalence in the livestock in both developed and developing countries, including Kazakhstan. According to the state veterinary service, prevalence of leukemia markers in the cattle is growing, which requires strengthening of the preventive policies and improvement in availability of diagnostic tools, particularly AGID, ELISA and PCR. Currently, such test systems in the domestic market are either imported, or assembled in Kazakhstan from the imported components. Of substantial importance is the development of laboratory prototypes of test systems for veterinary medicine produced with utilization of domestic technologies.
This paper describes a method for isolating of DNA from bovine blood, which is suitable material for diagnostic PCR. The paper presents chemical compositions and preparation protocols for all components of a prototype kit for the blood DNA isolation.
The real time polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect bovine leukemia virus in bovine blood. This article describes the sequences of primers and probes, and optimal reaction conditions for RT-PCR. The RT-PCR system detects an integrated provirus which is present in the DNA of infected animals and, for convenience of quality control, it contains an internal amplification control. The study of panel of bovine samples (n=112) found good correlation between the ELISA and RT-PCR, i.e. concordance for 89% of samples, and assuming the commercial ELISA test system as a «gold standard», the sensitivity and specificity of RT-PCR were 80 and 100%, respectively.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bumy A., Bruck C., Chantrenne H. (1980). Bovine leukemia virus: molecular biology and epidemiology. Viral epidemiology and oncology. - 231-289.
2. House J.A., Glover F.L., House C. (1975). Current aspect of bovine leukemia. Proc Annu Conv Am Assoc Bovine Pract 8: 147-150.
3. Кабдулова С.С. Эпизоотологический мониторинг при лейкозе крупного рогатого скота в Республике Казахстан и Акмолинской области // Вестник науки КАТУ им. С. Сейфуллина. – 2010. - №3. – С. 66-71.
4. Отраслевой мастер-план «Развитие производства молока и молокопродуктов» Министерства сельского хозяйства РК // http://www.minagri.kz/images/master_plan/ms_pl_moloko.pdf.
5. Дробот Е.В. Результаты изучения генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенности эпизоотологического и гематологического проявления лейкоза. – Новосибирск, 2007. - С. 110.
6. Miller J.M., Van der Maaten MJ. (1974). A complement-fixation test for bovine leukemia (C-type) virus. J Natl Cancer Inst 53: 1699-1702.
PubMed
7. Miller J.M., Olson C. (1972). Precipitating antibody to an internal antigen of C-type virus associated with bovine lymphosarcoma. J Natl Cancer Inst 49:1459-1461.
PubMed
8. Miller J.M., Van der Maaten MJ. (1976). Serologic detection of bovine leukemia virus infection. Vet Microbiol 1: 195-202.
9. Have P., Hoff-Jorgensen R. (1991). Demonstration of antibodies against bovine leukemia virus (BLV) by blocking ELISA using polyclonal anti-BLV immunoglobulin. Vet Microbiol 27:221-229.
CrossRef PubMed
10. Portetelle D, Bruck C, Mammerickx M, Burny A. (1983). Use of monoclonal antibody in an ELISA test for the detection of antibodies to bovine leukaemia virus. J Virol Methods 6: 19-29.
CrossRef PubMed
11. Graves D.C., Diglio C.A., Ferrer J.F. (1977). A reverse transcriptase assay for detection of the bovine leukemia virus. Am J Vet Res38:1739-1744.
PubMed
12. Roberts D.H., Lucas M.H., Wibberley G, Chasey D. (1982). An investigation into susceptibility of cattle to bovine leukosis virus following inoculation by various routes. Vet Rec 110:222-224.
PubMed
13. Jacobs R.M., Song Z, Poon H. (1992). Proviral detection and serology in bovine leukemia virus-exposed normal cattle and cattle with lymphoma. Can J Vet Res 56:339-348.
PubMed
14. Kelly E.J., Jackson M.K, Marsolais G. (1993). Early detection of bovine leukemia virus in cattle by use of the polymerase chain reaction. Am J Vet Res 54:205-209.
PubMed
15. Kuzmak J, Skorupska A, Moussa A, Grundboeck J. (1993). Application of non-radioactive method of DNA detection in the diagnosis of bovine leukaemia virus infection. Bull Vet InstPulawy 37:3-8.
16. Murtaugh M.P., Lin G.F., Haggard D.L. (1991). Detection of bovine leukemia virus by the polymerase chain reaction. J Virol Methods 33:73-85.
17. Naif H.M., Brandon R.B., Daniel R.C., Lavin M.F. (1990). Bovine leukemia proviral DNA detection in cattle using the polymerase chain reaction. Vet Microbiol 25:117-129.
18. Naif H.M., Daniel R.C., Cougle W.G., Lavin M.F. (1992). Early detection of bovine leukemia virus by using an enzyme-linked assay for polymerase chain reaction-amplified proviral DNA in experimentally infected cattle. J Clin Microbiol 30:675-679.
PubMed
19. Sherman M.P., Erlich G.D., Ferrer J.F. (1992). Amplification and analysis of specific DNA and RNA sequences of bovine leukemia virus from infected cows by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 30:185-191.
PubMed
20. Zielenski R., Geissler K., Walter T. (2009). US 7,491,495 В2. C12Q 1/68:22.
21. Евтушенко В.И. (1998). РФ 2116795. А61К35/66, С07Н21/04:5.
22. Wang T.Y., Wang L., Zhang J.H. (2011) A simplified universal genomic DNA extraction protocol suitable for PCR Genetics and Molecular research:519-525.
CrossRef PubMed
23. Bost D.F., Greenfield L.(2010). US 2010/0021905 A1 C12Q 1/68:39.
24. Collins, K.D. (1997). Charge density-dependent strength of hydration and biological structures. Biophys. J. 72: 65–76.
PubMed
25. Верховский О.А. и соавт. Иммуноферментный анализ в диагностике крупного рогатого скота // Ветеринария. – 2002. - №12. – С. 8-10.
Дата добавления: 2014-12-20; просмотров: 74 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |