Читайте также:
|
Определенные затруднения возникают при окраске кислых
фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно
заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию
анионными красителями. Конечно, можно использовать такие
положительно заряженные (катионные) красители, как толуи-
диновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они
дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда не-
сет на себе некоторое количество отрицательно заряженных ос-
татков акриловой кислоты.
Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая
степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам,
поэтому можно использовать ионы А13+ для блокирования заря-
дов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков
кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендо-
вана следующая смесь: 0,05% СВВ R-250+0,1 M A1(NO3)3+10%
уксусной кислоты + 25% изопропанола + 1% Тритона Х-100. От-
мывают гель, как обычно, в 7%-ной уксусной кислоте [Hege-.
nauer et al., 1977].
Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты
можно окрасить одновременно красителем с выразительным
фирменным названием «Stains-all», формула которого представ-
лена ниже.
0,1%-ный маточный раствор этого красителя в формамиде
можно хранить при 4° в темной бутыли в течение месяца. Его ра-
бочая концентрация—0,0012% в 0,01 М Трис-НСl (рН 8,5) с
5% формамида и 25% изопропанола. Окрашивать гель следует
в темноте, в течение ночи. Можно затем отмывать гель в воде, но
делать это не обязательно, так как на свету находящийся в геле
свободный краситель быстро выцветает, в то время как связан-
ный с белком оказывается значительно более стойким. Замеча-
тельно, что разные по своей природе биополимеры окрашивают-
ся при этом в различные цвета: гликопротеиды—в синий, бел-
ки — в красный, липиды — в желто-оранжевый, ДНК — в синий,
а РНК — в голубовато-пурпурный. Однако по чувствительности
этот универсальный краситель заметно уступает специализиро-
ванным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДДС-Na,
который из-за этого приходится отмывать после электрофореза,
вымачивая гель в течение 18—36 ч в 25%-ном растворе изопро-
панола [King, Morrison, 1976].
Если примириться с некоторой диффузией полос во время ок-
рашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных
буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости
от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих слу-
чаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаи-
модействия. В области нейтральных рН такие кислые красители,
как СВВ, бромфеноловый синий и «Fast green», заряжены отри-
цательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже рН 3,5. Ще-
лочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и
пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд
(р I >9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях мож-
но красить щелочными красителями, а щелочные—кислыми.
Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтра-
лизуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (рН 7)
до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления
избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин,
затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть
фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси ме-
танол—вода (1: 2), что стабилизирует окраску. Окрашенные ге-
ли хранят в разбавленных водных растворах красителей во избе-
жание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика
азид натрия до концентрации 0,01% [Ruchel et al., 1978].
Недавно был предложен принципиально новый способ окрас-
ки белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по
утверждению авторов, на два порядка более высокую чувстви-
тельность, чем СВВ R-250 [Merril et al., 1979]. Белки окраши-
вают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов
меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, рас-
творенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель пред-
варительно обрабатывают формальдегидом. После первой обра-
ботки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно кон-
центрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и,
наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формаль-
дегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окра-
шивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением се-
ребра в фотографическом процессе, так как «передержанный»
гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии.
Несмотря на свою огромную чувствительность, предложен-
ный способ достаточно сложен и связан с расходом дорогостоя-
щего нитрата серебра, поэтому в середине 1980 г. другая группа
авторов опубликовала упрощенную методику высокочувстви-
тельной окраски белков серебром, дающую, по-видимому, такие
же результаты [Oakley et al., 1980]. Ввиду перспективности это-
го метода цитируем его подробно.
95
Все растворы готовят на бидистилляте, а работу ведут в перчатках. При-
веденный ниже режим обработки соответствует пластинам размером 140x
x140x0.8 мм; для более толстых гелей продолжительность обработки на
каждом этапе надо увеличить. При всех процедурах, кроме одной, используют
осторожное перемешивание растворов на ротационной мешалке («New Bruns-
wick gyrotory shaker», модель 2) со скоростью 40 об/мин. Ниже описаны со-
ответствующие процедуры.
Гель вымачивают в течение 30 мин в 10%-ном водном растворе глутаро-
вого альдегида, споласкивают в течение 10 мин в 0,5—1 л воды с двумя сме-
нами и оставляют для набухания в воде не менее чем на 2 ч. Затем воду сли-
вают и заливают гель свежеприготовленным раствором аммиачного серебра.
Для получения 100 мл этого раствора добавляют 1,4 мл свежего концентри-
рованного раствора аммиака к 21 мл 0,36%-ного раствора NaOH, а затем с
энергичным перемешиванием медленно прибавляют 4 мл 19,4%-ного раствора
азотнокислого серебра (20 г AgNO3+100 мл воды). При этом может времен-
но образоваться коричневый осадок. После его растворения добавляют воду
до объема 100 мл. Для создания хорошей, ровной окраски и во избежание
прилипания геля ко дну надо, чтобы он свободно плавал в ванночке размером
20Х20 см со 150 мл раствора аммиачного серебра. Скорость перемешивания
в это время следует увеличить до 75 об/мии. Окрашивание должно длиться не
более 15 мин, чтобы серебро не успело осесть на поверхности геля. Так как
раствор аммиачного серебра при высыхании может взрываться, после его ис-
пользования серебро осаждают в виде AgCl подкислением НС1. Гель вынима-
ют из раствора и промывают водой в течение 2 мин. Чтобы он не прилип к
кювете, здесь и на следующем этапе следует не сливать жидкость, а перено-
сить его из кюветы в кювету. Затем гель переносят в свежеприготовленный
раствор, содержащий 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида.
(разбавлен из продажного 3'8%-ного формальдегида в 10%-ном метаноле); при этом и проступают полосы белков. Гель вынимают, когда фон только на-
чинает темнеть, и промывают водой в течение часа с тремя сменами при пере-
мешивании. Если концентрация ПААГ превышает 10%, то фон может ока-
заться темным. Он уменьшается в случае предварительной фиксации белков в
10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола в течение 30 мин и последующей
промывки геля в 7%-ной уксусной кислоте с 5% метанола в течение ночи.
Минимальная концентрация белка в полосе, которую можно
обнаружить, составляет примерно 10-4 мкг/мм2. По приведенным
в работе фотографиям создается впечатление, что чувствитель-
ность метода столь же высока, как и первоначальной методики
Меррила и соавторов, но четкость линий немного хуже. В этом
случае также возможно ослабление с помощью фотоослабите-
лей.
Хотя в рассмотренной работе об этом и не говорится, Меррил
и соавторы указывают, что после окрашивания серебром гели
становятся хрупкими. Для высушивания их рекомендуется пред-
варительно подвергнуть следующей обработке: вымочить в тече-
ние 15 мин в 30%-ном водном растворе тиосульфата натрия, про-
мыть 4 раза по 15 мин в воде и, наконец, вымочить в смеси ме-
танол — вода — глицерин (70: 27: 3) в течение 5 мин.
В начале 1981 г. Меррил и соавторы предложили еще одну
методику окрашивания белков в геле серебром. В отличие от их
первого метода, где был использован гистологический подход, в
данном случае восстановление серебра происходит фотохимиче-
ским путем.
После двумерного разделения белков в ПААГ по 0'Фарреллу их фиксиру-
ют и одновременно вымывают ДДС-Na сначала раствором, содержащим 12%
СН3СООН и 50% метанола (10 мин), потом дважды по 5 мин—5%-ной
СН3СООН с 10% этанола. Далее для улучшения равномерности окраски гель
вымачивают 5 мин в 0,5%-ном растворе железосинеродистого калия (красной
кровяной соли). После трехкратного ополаскивания в воде гель заливают рас-
твором, содержащим 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл
37%-ного формальдегида и 0,06 мг бензотриазола (антивуалирующего сред-
ства для фотографии) в 100 мл воды. Гель в растворе освещают вольфраме-.
вой лампой накаливания мощностью 1500 Вт в течение 20 мин. Затем раствор
сливают и гель, не споласкивая, заливают 200 мл 3%-ного раствора Na2CO3,
содержащего 0,1 мл формальдегида и 0,12 мг бензотриазола. Окраска появ-.
ляется уже через 1 мин. Не прекращая освещения, раствор сменяют 2—3 раза
до достижения желаемой интенсивности окраски белков. Процесс окрашива-
ния прерывают погружением геля на 5 мин в 1%-ный раствор СН3СООН,
а затем промывают его водой.
Чувствительность метода столь же высока, как и у ранее опи-
санных методов окраски серебром, но процедура существенно
проще, дешевле и занимает всего 1 ч [Merril et al., 1981].
Дата добавления: 2015-09-11; просмотров: 76 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |