Читайте также:
|
Из изложенного ясно, что рН буфера в этом варианте элект-
рофореза не играет существенной роли, так как заряд белка оп-
ределяется его комплексированием с ДДС-Na. Обычно работают
с нейтральными буферами. По традиции, идущей еще от пионер-
ской работы Вебера и Осборн [Weber, Osborn, 1969], часто ис-
пользуют 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 7,1. Его концентрация
обусловлена только желанием обеспечить 10-кратное различие в
электропроводностях буферов геля и препарата. В качестве по-
следнего берут 0,01 М Na-фосфат, рН. 7,1. Как уже указывалось,
такое различие обеспечивает концентрирование исходной поло-
сы при переходе белков из буфера препарата в гель. Однако
ввиду большой электропроводности Na-фосфатного буфера на-
пряженность поля приходится ограничивать значением 5 В/см,
что замедляет процесс разделения, поэтому вместе Na-фосфат-
ного имеет смысл использовать другой, менее проводящий бу-
фер, например имидазолфосфатный, рН 7. Молярность рабочего
буфера можно снизить до 0,05 М, сохранив для буфера препара-
та концентрацию 0,01 М. Это позволит значительно увеличить
напряженность поля и сократить продолжительность электрофо-
реза.
В электродных резервуарах обычно используют тот же буфер,
что и в геле. В буферы вносят и ДДС-Na до концентрации 0,1%.
Необходимость присутствия ДДС-Na в рабочем буфере геля
одно время оспаривалась [Stoklosa, Latz, 1974]. Авторы цити-
руемой работы утверждали, что ДДС-Na образует с белком
прочный комплекс, не разрушающийся в процессе электрофоре-
за. В более поздней работе, напротив, подчеркивается необходи-
мость введения ДДС-Na в буфер геля или хотя бы в катодный
буфер, откуда он будет поступать в гель. Показано, что ДДС-Na
может выходить из комплекса с белком. В тех случаях, когда
скорость миграции детергента в геле намного больше, чем бел-
ка, последний будет терять ДДС-Na и изменять свою подвиж-
ность в геле [Kubo et al., 1979]. Это обстоятельство было пред-
ложено использовать в своеобразном процессе двухстадийного
электрофореза [Sorimachi, Condliffe, 1977]. После обычной об-
работки ДДС-Na и b-меркаптоэтанолом авторы сначала вели
электрофорез в течение 2 ч в 10%-ном ПААГ, полимеризован-
ном, как обычно, в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7) с 0,1%
ДДС-Na. Через некоторое время буфер в катодном резервуаре
заменяли на такой же, но без ДДС-Na. Это приводило к быст-
рой очистке геля от детергента, мигрирующего к аноду. Затем
от ДДС-Na освобождались и белки. Дальнейшее разделение шло
уже по заряду белков. При этом рН буфера можно с самого на-
чала выбрать оптимальным именно для второго этапа разделе-
ния, поскольку на первом этапе в присутствии ДДС-Na рН роли
не играет.
Дата добавления: 2015-09-11; просмотров: 87 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |