Читайте также:
|
Реакцию проводят по методу, описанному Jondal и соавт. в 1972 г. В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5 % взвеси эритроцитов барана. Соотношение эритроциты: лимфоциты не должно превышать 50:1. Инкубируют смесь в термостате 37 °С в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) и оставляют на ночь в холодильнике при температуре 4 °С. Подсчет клеток мы рекомендуем проводить в камере Горяева. Существующий метод фиксации суспензии глютаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и просчетом розеток в окрашенных препаратах позволяет накапливать стекла и анализировать результаты реакций в другой, свободной от постановки или менее загруженный, день. Однако глутаровый альдегид изменяет поверхность эритроцитов барана, вызывает неспецифическое прилипание их к клеткам крови человека. Не исключено, что глутаровый альдегид десеквестрирует скрытые антигены в мембране бараньих эритроцитов, к которым имеются рецепторы у лимфоцитов человека. Более перспективен в этом плане ацетальдегид, фиксация которым эритроцитов стандартизирует определение Т-лимфоцитов и делает возможным обоснованное сопоставление результатов, полученных разными лабораториями. Для просчета клеток в камере Горяева осадок клеток в извлеченных из холодильника пробирках осторожно ресуспендируют пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл 0,01 % раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2—3 мин заполняют камеру Горяева и определяют процент Е-РОК путем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет процедуру счета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розоватыми эритроцитами.
В день взятия крови на Т-лимфоциты необходимо проводить общий анализ крови, который дает возможность высчитывать абсолютные значения Т-клеток.
Нормальные величины Т-клеток, определенные у 150 здоровых доноров: 54,3 ± 0,98%; 979,8 ± 16,8 кл/мкл.
Определение активных Т-лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана (ЕА-РОК).
Все подготовительные операции выполняют так, как это описано для Е-РОК, за исключением сыворотки, которую при определении ЕА-РОК не добавляют в инкубационную среду, и длительной холодовой инкубации. После термостатирования 10 мин при 37 °С и последующего центрифугирования при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) в течение 5 мин проводили подсчет Т-активных лимфоцитов способом, описанным выше для общих Т-клеток.
Содержание Т-активных лимфоцитов у 150 здоровых доноров составило: 34,6± 1,92 %, 840 ± 123 кл/мл.
Дата добавления: 2015-02-22; просмотров: 76 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |