Читайте также:
|
Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций следующие.
1. Микроскопический метод исследования: а) в световом микроскопе; б) в люминесцентном микроскопе; в) в электронном микроскопе.
2.Выделение и культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов, лабораторных животных и культур клеток.
3.Серологический метод исследования (идентификация вирусов) — постановка серологических реакций (РЗГА, РН и др.).
4. Биологический метод.
5. Генетические методы (ПЦР, рестрикционный анализ).
Микроскопию в световом микроскопе проводят с целью выявления крупных вирусов-вирионов, внутриклеточных включений и изучения патологических изменений клеток, пораженных вирусами (ЦПД). Вирион — это зрелый внеклеточный вирус. Включения представляют собой вирусный материал, находящийся внутри клетки, в образовании которого участвуют и клеточные продукты. Вирионы могут быть обнаружены в мазках и препаратах-отпечатках из инфицированной ткани; включения — только в препаратах-отпечатках и гистосрезах, приготовленных из пораженных органов и тканей.
Оспа овец, свиней и коров, эктима овец, оспа-дифтерит птиц — это такие инфекции, при которых обнаружение вирионов-возбудителей приобрело диагностическое значение. Для выявления вирионов используют методы окрашивания, которые позволяют увеличить вирусную частицу в размерах и сделать ее более контрастной. В целях получения хороших результатов используют чистые обезжиренные предметные стекла. Препараты готовят из тщательно размельченного материала или путем отпечатков стараясь сделать их как можно тоньше. При каждом вирусном заболевании учитывают, какие органы и ткани наиболее поражены и какие участки их следует исследовать, выбирают также соответствующий метод фиксации. Существует ряд методов окраски вирионов.
Окраска по Морозову применяется в процессе диагностики оспы овец. Возбудителей болезни выявляют в препаратах-отпечатках, мазках из чистых суспензий. При исследовании последних на предметное стекло пастеровской пипеткой наносят небольшую каплю материала и распределяют ее тонким слоем, для окрашивания готовят три реактива.
Реактив №1 (фиксатор — жидкость Руге): 2 мл 40%-ного формальдегида (продажный формалин), 1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды.
Реактив №2 (протравитель): 5 г танина, 2 мл жидкого фенола, 100 мл дистиллированной воды (если появляется осадок, раствор фильтруют).
Реактив №3 (краситель): 5 г азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, затем осторожно по каплям добавляют раствор 25%-ного аммиака до появления легкой опалесценции. Перед употреблением разводят дистиллированной водой 1:10.
Готовые препараты высушивают на воздухе, 2...3 мин отмывают дистиллированной водой в вертикальном положении. Затем на них наносят реактив №1, через 1 мин его сливают, мазок промывают и наносят на 1...2 мин реактив №2, проводя препарат над пламенем спиртовки до появления паров. Далее мазок тщательно промывают дистиллированной водой и на 1...2 мин наносят реактив №3, прогревая препарат на огне, пока он не станет темно-коричневым. После этого препарат снова тщательно промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.
На светло-коричневом фоне препарата вирионы имеют вид темно-коричневых или черных точек, расположенных одиночно, попарно или в виде скоплений. Результат будет положительным только в случае массового обнаружения характерных образований.
Окраска по Маккиавелло сводится к следующему. Высушенные нефиксированные препараты окрашивают 5 мин профильтрованным 0,25%-ным раствором основного фуксина, краситель сливают, а мазок быстро (1с) проводят через 0,5%-ный раствор лимонной кислоты, тщательно промывают водопроводной водой и окрашивают 5-10 с 1%-ным раствором метиленовой сини. Затем препарат вновь промывают, высушивают и микроскопируют.
Вирионы окрашиваются в яркий рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток — в светло-синий, ядра — в темно-синий.
Окраска по Романовскому-Гимзе заключается в том, что препараты фиксируют в метиловом спирте 5 мин, нанося на них раствор краски Романовского-Гимзы (1 мл маточного раствора на 10... 15 м. дистиллированной воды), окрашивают 30... 60 мин, краску сливают и тщательно промывают дистиллированной водой в течение 10... 15 мин. Высушенные препараты лучше провести через абсолютный спирт, толуол и заключить в бальзам. Вирионы при этом способе окрашивания приобретают темно-фиолетовый цвет, фон препарата — голубой.
При некоторых вирусных инфекциях диагностическим признаком является образование в клетках особых включений. Они обнаруживаются при бешенстве, оспе, гриппе свиней, чуме собак, болезни Ауески и др. Специальными методами окраски выявляются как внутрицитоплазматические, тик и внутриядерные включения. Наиболее часто они используются при диагностике бешенства.
Окраска по Муромцеву. Препарат фиксируют метиловым спиртом, отмывают от фиксатора и окрашивают 10 мин синькой Мансона (в 100 мл кипящей дистиллированной веды растворяют 5-6 г химически чистой буры, добавляют 2 г метиленовой сини, охлаждают и фильтруют) в разведении 1:40. Непромытый мазок выдерживают в 10%-ном растворе танина до тех пор, пока он не приобретет вместо сине-фиолетового цвета голубой. Затем его промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и в течение нескольких секунд проводят через абсолютный спирт. После этого высушивают и микроскопируют. Включения Бабеша-Негри представляют собой фиолетовые образования различных размеров (0,2...20 мкм) и формы на голубом фоне цитоплазмы, ядра клеток окрашиваются в синий цвет.
Окраска по Манну. Препарат фиксируют в жидкости Буэна 2 ч и окрашивают 4 ч при 37 °С или 18 ч при комнатной температуре в растворе следующего состава:
17мл 1%-ного раствора метиленовой сини, 23 мл 1%-ного раствора эозина, 40 мл дистиллированной воды. Раствор готовят перед употреблением. После окрашивания препарат тщательно промывают и обезвоживают в трех растворах щелочного спирта: 1) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 30 капель 1%-ного раствора каустической соды в этом спирте, 2) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 20 капель раствора соды, 3) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 10 капель раствора соды. Обезвоживание прекращают, если препарат принимает светло-розовый оттенок. Такой препарат проводят через абсолютный спирт и обезвоживают в кислом спирте (30 мл абсолютного спирта и 1 капля ледяной уксусной кислоты). На фоне голубых клеток видны ярко-красные включения, синие ядра и ядрышки клеток.
Окраска по Туревичу. Препарат фиксируют в метиловом спирте. Для проведения окраски необходимо иметь следующие реактивы: железный гематоксилин Вейгерта, 1%-ный водный раствор кислого фуксина, насыщенный раствор пикриновой кислоты, разведенный пополам 96° спиртом.
Для получения железного гематоксилина Вейгерта готовят два состава: 1) 1%-ный раствор гематоксилина в 96° спирте. Раствор должен созревать в течение 2...3 недель;
2) 1,16 г хлористого железа, 98 мл дистиллированной воды и 1 мл концентрированной соляной кислоты. Перед употреблением смешивают равные количества обоих растворов. Как только смесь приобретает фиолетовый оттенок, ее наносят на препарат и окрашивают 1...2 мин, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1%-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дистиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После промывки дифференцируют раствором пикриновой кислоты в течение 10 - 20 с до появления желтого оттенка. Препарат быстро прополаскивают в дистиллированной воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой, проводят через абсолютный спирт или ксилол и заключают в бальзам. Тельца Бабеша-Негри — вишнево-красного цвета, ядра клеток — черные на серо-желтом фоне цитоплазмы.
Кроме указанных методов, для выявления включений можно использовать окрашивание по Романовскому-Гимзе. Включения при этом приобретают темно-фиолетовый цвет, цитоплазма — голубой.
Дата добавления: 2014-12-20; просмотров: 99 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |