Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Краткие теоретические сведения. В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является важнейшим принципом контроля за их распространением.

В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является важнейшим принципом контроля за их распространением.

Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний животных и птиц представляет собой одну из наиболее важных задач ветеринарной бактериологии и вирусологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, - начиная от клинических методик вирусологического и бактериологического тестирования и кончая иммунохимическими и молекулярно-биологическими методами. В каждом случае характер и сложность диагностических приемов зависят от биологии возбудителя инфекции. В отличие от растений и животных микроорганизмы как правило лишены отличительных морфологических и поведенческих свойств, позволяющих определять их принадлежность к определенным таксонам. Поэтому для идентификации патогенных микроорганизмов широко привлекаются биохимические, серологические и молекулярно-генетические подходы. Биохимический анализ выделенного возбудителя в большинстве случаев дает возможность правильно установить родовую или видовую его принадлежность. Однако существенным недостатком данного подхода является требование предварительного выделения возбудителя в виде чистой культуры. Некультивируемость микроорганизмов - главная причина, по которой культуральный метод все более и более теряет свои позиции по мере появления альтернативных подходов. При этом под некультивируемостью мы понимаем как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться из-за широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Помимо этого, для многих возбудителей культуральный метод представляет собой трудоемкую, длительную и дорогостоящую процедуру. В то же время традиционные серологические тесты: РСК, РДП, РГА, а порой и наиболее перспективные методы диагностики - иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ), оказываются фактически неэффективными или принципиально неприемлемыми для выявления инфекционных возбудителей по причине, главным образом, их низкой чувствительности.

Поэтому в последнее время все большее распространение получают новейшие методы диагностики, основанные на обнаружении в исследуемых клинических образцах специфических нуклеотидных последовательностей генома микроорганизмов. Генодиагностика — это комплекс методов, которые позволяют обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определения вида возбудителя инфекционного заболевания. Геноди­агностика — относительно новый раздел диагностики, возникший гораздо позже методов, основанных на микробиологических и иммунологических принципах. Поэтому возможности и области применения этого ме­тода еще не так широко известны микробиологам и эпизоотологам. В связи с этим целью данного обзора является рассмотрение как современного состояния генодиагностики, так и областей ее применения. Это, по нашему мнению, позволит показать, что генодиагностика возникла не для того, чтобы потеснить имеющие­ся микробиологические и иммунологические методы, а, наоборот, чтобы дополнить их, позволяя решать те за­дачи диагностики инфекционных заболеваний, которые ранее были не доступны классическим методам.

Создание всего нового, в том числе и новых методов диагностики, возможно только на основе фундамен­тальных разработок. Становление и совершенствова­ние генодиагностики тому яркий пример. Начиная с 1953 г., когда Дж. Уотсон и Ф. Крик опубликовали ра­боту, посвященную структуре ДНК, стало ясно, что ос­новной принцип, лежащий в основе всего живого – принцип комплементарности. Однонитевая цепь ДНК для образования двунитевого комплекса взаимодейству­ет с цепью ДНК, обладающей комплементарной после­довательностью. С этих пор данный принцип стал ши­роко и успешно использоваться для решения различ­ных, более частных проблем, в том числе и для диагно­стики патогенных микроорганизмов.

До конца 80-х годов реакция гибридизации ДНК с ДНК была основой генодиагностики. Для проведения этой реакции необходимо было располагать клониро­ванной последовательностью ДНК, которую использо­вали в качестве молекулярного зонда. Молекулярный зонд должен быть специфичным по отношению к ДНК тестируемого микроорганизма, а также желатель­но быть частью гена, кодирующего синтез одного из факторов патогенности. При использовании молеку­лярного зонда, удовлетворяющего этим требованиям, можно не только идентифицировать микроорганизм, но и давать заключение о его вирулентном потенциале и эпидемиологической значимости, что особенно важно при исследовании микроорганизмов, выделяемых из объектов внешней среды.

Использование молекулярного зондирования позво­лило в значительной степени изменить ряд представле­ний о диагностике инфекционных заболеваний. Было доказано, что тестирование генов факторов патогенно­сти во многих случаях более информативный подход по сравнению с исследованием различных фенотипических свойств, таких как определение серотипа, фаготипа, способности агглютинироваться в присутствии спе­цифических сывороток, которые далеко не всегда отра­жают корреляционные связи с вирулентностью иссле­дуемого микроба.

Однако метод генодиагностики, основанный на ре­акции гибридизации ДНК с ДНК, не отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать 10⁴-10⁵ мишеней (это могут быть бактериальные клетки, вирусные частицы или очищенная нуклеиновая кисло­та) в пробе. В связи с этим данный подход является ма­ло информативным при диагностике тех инфекцион­ных состоянии, при которых концентрация микробов ниже порога чувствительности метода, а сами микробы в силу тех или иных причин не размножаются в лабора­торных условиях. С такими ситуациями микробиологам приходиться сталкиваться повсеместно: например при диагностике хронических инфекционных состоянии, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов. Те же трудности приходится преодолевать при иденти­фикации практически всех внутриклеточных парази­тов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы, требующих для своего культивирования или очень сложных питательных сред, или же клеточных, или тка­невых культур.)

Следующим шагом фундаментальной науки — моле­кулярной биологии гена — было создание способа ис­следования, получившего название полимеразной цеп­ной реакции (ПЦР), позволяющего не только преодо­левать вышеперечисленные трудности, но и открываю­щего новые возможности при лечении и эпидемиологи­ческом анализе инфекционных заболеваний.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мullis, полу­чившим за это Нобелевскую премию в 1993 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помо­щью фермента ДНК-полимеразы определенного фраг­мента ДНК, который является маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементар­ное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определен­ных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой спе­циально синтезированные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 нуклеотидов, называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате проис­ходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2ⁿ, где п — чис­ло циклов амплификации. Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер оп­ределяется числом олигонуклеотидных пар между 5'-концами праймеров. Обычно размер фрагмента состав­ляет несколько сотен нуклеотидных пар.

Построение новых ДНК нитей из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термоста­бильная ДНК-полимераза, называемая Таq-полимеразой. Процесс амплификации заключается в повторе­нии циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК (1 мин), отжига праймеров (1—2 мин) и построе­ния фрагмента (1—2 мин). В результате 30—35 циклов амплификации синтезируется 10⁸ копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы по­зволило автоматизировать процесс амплификации с по­мощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу цик­лов амплификации.

Таким образом, ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах — процессу биоло­гической амплификации, при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 10⁵—10⁶ раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективны­ми, поддерживающими рост только одного микроорга­низма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микробов, так и прайме­ры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов. Но в то же время ПЦР имеет принципиальное преиму­щество перед культуральными методами. Диагностиче­ские потенции ПЦР не ограничены способностью мик­роба расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувст­вительности ПЦР-метода (так как чувствительность этих методов сопоставима), а в способности идентифи­цировать и определять свойства тех микроорганизмов, которых не удается по тем или иным причинам размно­жать в лабораторных условиях. Здесь уместно отме­тить, что идентификационные тест-системы, основан­ные на ПЦР, разрабатываются для микроорганизмов с известными к данному моменту последовательностями ДНК в интересующих генах.

Наивысшая чувствительность ПЦР обычно достига­ется при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим ма­териалом. На успех определения при работе с этим ма­териалом влияют такие факторы, как методика приго­товления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем об­разца при низких концентрациях тестируемых молекул.

Наибольшее внимание среди этих методов привлекает полимеразная цепная реакция (ПЦР) в основе которой лежит многократное повторение циклов удвоения (амплификация) специфического участка нуклеотидной последовательности. Главное достоинство метода - очень высокая чувствительность: в результате амплификации концентрация специфической олигонуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в десятки миллионов раз. За последние 10 лет достигнут зна­чительный прогресс в изучении молеку­лярной основы наследственных болез­ней и в их диагностике с помощью молекулярного анализа ДНК- В первую очередь это относится к болезням, кото­рые вызваны мутацией в одном гене (моногенным). Каждый год увеличи­вается список наследственных болезней, которые могут быть выявлены методами анализа последовательности нуклеино­вых оснований хромосомной ДНК.

Появилась возможность с помощью исследования образцов ДНК поставить диагноз наследственного заболевания еще до появления клинических симпто­мов или в пренатальный период. Это позволяет выявить носителей мутантного гена при аутосомно-рецессивных бо­лезнях, а также распознать фенотипически сходные, но генетически различ­ные заболевания. В настоящее время расширяется сфера применения этих методов. Помимо диагностики болезней с установленным типом наследования, они начинают использоваться для изучения и мультифакториальных заболеваний (коро­нарная болезнь сердца, сахарный диа­бет, опухоли и др.), а также для иден­тификации личности, установления отцовства и др.

Особую диагностическую ценность ДНК-анализ приобретает при тех наследственных болезнях, при которых неизвестен биохимический дефект, ле­жащий в их основе, и которые поэтому не могут быть выявлены тради­ционными методами лабораторной диагностики. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень).Ключом к расширению клиническо­го применения достижений современной молекулярной генетики являются не только разработка методов рекомбинантной ДНК, но и значительное упро­щение технологии проведения ДНК-анализа, повышение чувствительности, быстроты и надежности методов с их последующей автоматизацией. Остановимся теперь более подробно на основных этапах технологии анализа.

Получение и хранение ДНК. Геномную ДНК выделяют с помощью многоступенчатых методов из тканей, содержащих ядерные клетки, в том чис­ле из лимфоцитов периферической кро­ви, лимфобластоидных клеточных ли­ний, а также из амниоцитов и ворсин хориона плода, полученных путем биопсии. Кровь для исследования бе­рут в количестве около 10мл с анти­коагулянтом: цитратом, глюкозоцитратным раствором (глюгициром) или ЭДТА. В большинстве лабораторий ДНК выделяют из взятых образцов в тот же день, но их можно и хранить при температуре —20°С. Первым этапом анализа ДНК является ее экстракция из тканей по стандартному методу. Клетки крови (или ворсин хориона) гемолизируют, обрабатывают протеиназой К в течение ночи для расщепления белков, экстра­гируют сопутствующие вещества фено­лом и хлороформом и осаждают нуклеиновые кислоты этанолом. Методы экстракции ДНК постоянно совершенствуются, разрабатываются различные модификации, направленные на ускорение и повышение эффектив­ности методов, а также исполь­зование менее вредных для исследо­вателя реактивов.

Количество и чистота препарата ДНК оцениваются спектрофотометрически. Экстрагированная ДНК стабильна и может храниться неопределенно долгое время. Это имеет большое зна­чение, так как образцы от людей с генетическими заболеваниями могут быть собраны и сохранены для будущих сопоставлений при обследовании дру­гих членов семьи, а также для про­ведения повторных исследований после получения ДНК-проб нового поколения. Обычно образцы ДНК дублируются и хранятся раздельно в двух морозильниках. Хранение ДНК обеспечивает возможность ДНК-диагностики в семьях, в которых по­жилые или страдавшие наследствен­ными заболеваниями родственники умерли до того, как стало возможным предсказательное тестирование. В случаях, когда пораженные родствен­ники уже умерли и ДНК лейкоцитов недоступна для анализа, оказалось возможным использовать заморожен­ную ткань мозга, взятую на аутопсии.

Для радиоизотопного анализа по Саузерну обычно требуется 5—10 мкг геномной ДНК, что составляет около 2-10^–18 мол. Такое количество ДНК присутствует приблизительно в 10⁶ ядерных клеток, которые могут быть выделены менее чем из 1 мл крови, а в случае пренатальной диагностики — из биоптата ворсин хориона или из амниоцитов. Еще меньшее, крайне незначительное количество ДНК необходимо в тех случаях, когда анализу предшествует амплификация (умножение) участка ДНК-мишени с помощью недавно раз­работанного метода, использующего повторные циклы полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В настоящее время используется несколько спосо­бов подготовки образца для проведения ПЦР. Про­цедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разруше­ния микробной клетки используют простое кипячение, замораживание—оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, а точнее природой его клеточной стенки. Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, классическую проце­дуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и в первую очередь от ингибиторов Таq-полимеразы, но неизбежны боль­шие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, осно­ван на использовании нуклеосорбентов. Подготовка материала с применением нуклеосорбента занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может гарантировать удаление возможных инги­биторов.

Зная возможности и преимущества этого метода, сформулируем те направления исследований в инфек­ционной патологии, в решении которых ПЦР начина­ет играть ведущую роль:

— диагностика хронических инфекционных состоя­ний, обусловленных персистенцией бактерий или виру­сов, — наиболее очевидная область применения ПЦР в диагностических целях;

— ПЦР — незаменимый инструмент при идентифи­кации и молекулярно-генетических исследованиях практически всех внутриклеточных и мембранных па­разитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы;

— ПЦР является наиболее эффективным способом выявления и изучения возбудителей сапронозов, кото­рые, находясь во внешней среде в "некультивируемом" состоянии, способны там сохраняться, переживая не­благоприятные внешние условия в межэпидемические периоды;

— ПЦР позволяет проводить определение антибиотикорезистентности у медленно растущих и труднокультивируемых бактерий;

— технология ПЦР коренным образом изменила способы маркирования штаммов для целей эпидемио­логического анализа, тем самым расширив его возмож­ности.

Теперь обратимся к конкретным примерам, которые показывают, как технология ПЦР позволяет решать пе­речисленные выше задачи.

На настоящий момент преимущество ПЦР-анализа перед "золотым стандартом" (так красиво называют культуральный метод выявления бактерий и вирусов) состоит в следующем: 1) более высокая частота обнаружения микроба, превышающая культуральный метод на 6— 7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные фор­мы микроорганизма; 2) время, необходимое для обна­ружения микроба культуральным методом, составляет около 4-6 сут., тогда как при использовании ПЦР через 4—5 ч; 3) использование технологии ПЦР позволяет проводить определение инфекционного агента в образцах, взятых неинвазивным путем.

Одной из наиболее интересных сфер приложения ПЦР в эпидемиологии является использование этой технологии для мониторинга объектов внешней среды. Помимо решения чисто прикладных задач (усовершен­ствование методик обнаружения возбудителей в пробах воды, почвы и т. д.) в этой области, ПЦР является важ­ным инструментом для получения фундаментальной информации о способах поддержания жизнеспособно­сти микроорганизмов вне связи с организмом животно­го или человека.

За последние 5—7 лет накоплен достаточно обшир­ный материал, свидетельствующий о способности мно­гих видов патогенных бактерий переходить в так назы­ваемое некультивируемое состояние. Формирова­ние некультивируемых форм бактерий сопровождается глубокими перестройками метаболизма и изменением морфологии бактериальной клетки. В результате клетки бактерий, сохраняя жизнеспособность, перестают де­литься и, будучи перенесены на плотную питательную среду, не формируют колоний. Однако переход в не­культивируемое состояние не является необратимым, и под воздействием изменяющихся условий внешней сре­ды некультивируемые клетки бактерий могут восста­навливать способность к пролиферации.

Очевидно, что некультивируемые формы бактерий нельзя выявить традиционными микробиологическими приемами, включающими посевы из исследуемых об­разцов на плотные питательные среды. Микроскопия с использованием витальных красителей в данном слу­чае может служить лишь инструментом изучения фор­мирования некультивируемых форм в лабораторном эксперименте. Показано, что переходить в некультиви­руемое состояние могут возбудители многих заболева­ний человека. Переход в некультивируемое состояние представляет собой способ поддержания жизнеспособ­ности в неоптимальных для активного роста условиях. Эта способность обнаруживается в первую очередь у патогенных бактерий—сапрофитов. Диагностика забо­леваний, вызванных многими из подобных инфекцион­ных агентов, успешно обеспечивается традиционными методами. Однако единственным в настоящее время методическим подходом, способным доказать присутст­вие в образце некультивируемых форм возбудителя, яв­ляется ПЦР. При использовании такого подхода проде­монстрировано, что эндемичность ряда природных оча­гов объясняется способностью возбудителей сапронозов сохраняться в объектах внешней среды в некультиви­руемом состоянии. Это положение, по нашему мнению, чрезвычайно важно для всей системы эпизоотоологического надзора, так как дает возможность, ис­пользуя технологию ПЦР, выявлять потенциально опасные штаммы возбудителей сапронозов раньше, чем они попали в человеческую популяцию и вызвали эпидемиологическое осложнение.

Большое значение приобретает метод ПЦР при кон­троле продуктов питания. Таким образом, технология ПЦР является мощным инструментом, обеспечивающим возможность фунда­ментального изучения хронических инфекционных процессов и экологии возбудителей инфекционных за­болеваний.

ПЦР — это метод амплификации in vitro, с помо­щью которого в течение нескольких часов можно выде­лить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходную в 10⁸ раз. При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирую­щие участок ДНК, специфический для определяемого возбудителя, процесс амплификации заключается в по­вторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последо­вательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразы. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок именуют "ампликоном". В ре­зультате происходит экспоненциальное увеличение ко­личества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2ⁿ, где n — число прошедших циклов ам­плификации. Поскольку праймеры физически включа­ются в концы продуктов застройки, они детерминиру­ют сам продукт реакции — фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5-концами праймеров на ис­следуемом участке ДНК. Процесс амплификации идет эффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из бактерии Thermus aquaticus (Tag). К достоинствам указанной полимеразы относится то, что нет необходимости ее замены после каждого цикла, а также сравнительно высокий темпера­турный оптимум детерминируемой ею реакции (70— 75°С). Праймеры для ПЦР обычно имеют длину, как правило, около 20 нуклеотидов.

Рассмотрим основные характеристики ПЦР-анализа.

Надежность — защищенность анализа от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Ложноположительный результат анализа является следстви­ем заражения образца или реактивов ДНК исследуемо­го образца или, что бывает чаще, амплификатом. В свя­зи с этим необходимо пространственное разделение ди­агностической лаборатории как минимум на три блока: в одном из них проводить приготовления ДНК-образ­ца, в другом — постановку амплификации и в третьем — электрофорез и индикацию. Перенос реактивов и оборудования между блоками должен быть исключен. Достаточным контролем является отсутствие сигнала для образца с заведомо отсутствующей ДНК исследуе­мого образца. Ложноотрицательный результат может быть вызван тривиальными причинами: недостаточной чувствительностью реакции, ошибками оператора в вы­делении ДНК и проведении амплификации и др. По­этому в каждой серии анализов присутствует положи­тельный контроль — образец с заведомо присутствую­щей матрицей для данных праймеров, например хромо­сомная ДНК искомого возбудителя инфекции. Кроме того, причиной ложноотрицательного результата может быть присутствие в образце ингибиторов реакции. При использовании всех указанных контролей, надежного оборудования и жестко стандартизованных реактивов метод ПЦР высоконадежен.

Чувствительность анализа характеризуется очень низкой концентрацией клеток или вирусных частиц в пробе, дающей положительный результат анализа, и определяется эффективностью методики выделения ДНК возбудителя, чувствительностью собственно ПЦР и чувствительностью выбранного метода индикации. Метод выделения ДНК должен быть еще дешевым и простым. ПЦР при оптимальных условиях крайне чув­ствительна: в модельной системе в сочетании с блотгибридизацией с радиоактивно меченным ДНК-зон­дом удается зарегистрировать 3—5 копий генома цитомегаловируса в пробе. Достигаются оптимальные усло­вия подбором температурно-временного режима, кон­центрации ионов магния, праймеров и фермента в ре­акционной смеси, применением при необходимости "горячего старта" — добавления фермента в реакцион­ную смесь, уже прогретую до температуры плавления ДНК. Достигнуть предельно высокой чувствительности при самых простых методах индикации позволяет и четырехпраймерная амплификация (ЧПА). ЧПА реализу­ет принцип "русской матрешки": вначале пара "внеш­них" праймеров запускает синтез первого ампликона, затем после нескольких циклов пара праймеров, ком­плементарных внутренним последовательностям перво­го ампликона, запускает синтез второго, меньшей дли­ны. В модельных системах при диагностике цитомегаловируса ЧПА в сочетании с электрофорезом в ПААГ и окрашиванием бромистым этидием дает возможность уверенно регистрировать порядка 10 геномов в пробе. Предел чувствительности ПЦР-диагностикума инфек­ционных заболеваний (при условии использования 100 мкл клинического образца) в 100—1000 возбудите­лей в 1 мл. Такой чувствительности могут достигать только культуральные методы диагностики.

Важным параметром является избирательность ана­лиза — способность диагностикума выявлять возбуди­телей инфекции конкретного вида на фоне любых дру­гих микроорганизмов, вирусов и клеток организма хо­зяина. С этой точки зрения возможности ПЦР-диагно-стикумов уникальны: соответствующим образом вы­бранная последовательность ДНК мишени (выбор праймеров) позволяет в зависимости от целей диагно­стикума выявлять вид и отдельные штаммы микроорга­низмов.

Уникальность метода обусловлена тем, что он обла­дает самой высокой чувствительностью и специфично­стью, превосходящими получаемые культуральным ме­тодом. Учитывая продолжительность и трудоемкость процедуры выращивания культуры клеток (до месяцев), преимущества ПЦР (5—8 ч) очевидны. Специалистами фирмы проведена сравнительная оценка эффективно­сти метода ПЦР по сравнению с традиционными мето­дами, показаны преимущества и ограничения примене­ния метода в клинической практике. Так, проведено сравнение результатов ПЦР-анализа и нерадиоизотопного гибридизационного анализа клинических образцов на содержание хламидия трахоматис и уреаплазма уреа­литикум с использованием в качестве метки комплек­сов платины и показано хорошее совпадение результа­тов, полученных указанными методами ДНК-диагно­стики. Исследованиями в ряде ведущих лабораторий мира на примере обнаружения в биологических пробах хламидия трахоматис показано, что методом ПЦР или лигазной цепной реакции определяют на 10—20% боль­ше положительных проб, чем культуральным методом или подтверждающими некультуральными методика­ми. Методом ПЦР в клиническом материале (соскоб клеток эпителия) нами обнаружено наличие двух биоваров уреаплазма уреалитикум. Важным параметром яв­ляется избирательность анализа — способность диагно­стикума выявлять возбудителей инфекции конкретного вида на фоне любых других микроорганизмов, вирусов и клеток организма хозяина. С этой точки зрения воз­можности ПЦР-диагностикумов уникальны: соответст­вующим образом выбранная последовательность ДНК мишени (выбор праймеров) позволяет в зависимости от целей диагностикума выявлять вид и отдельные штам­мы микроорганизмов.

Забор материала. Как правило, это соскоб эпители­альных клеток со слизистой цервикального канала или уретры, могут использоваться слюна, выделения, моча, у детей — соскоб с миндалин. Собранный биоматериал желательно сразу использовать для анализа. Хранить биоматериал можно при —20°С не более 0,5 мес. Со­скоб из цервикального канала желательно брать в сере­дине менструального цикла. У лиц, принимающих ан­тибиотики, уросептики, наркотические вещества, взя­тие биологического материала для анализа следует про­изводить через 14 сут после их отмены.

ЗАО "ВСМ" производит набор лабораторных изде­лий и поставляет "под ключ" диагностические центры для ПЦР-диагностики, обеспечивает гарантийное и постгарантийное обслуживание оборудования, прово­дит обучение методу. Минимальный набор состоит из следующих приборов:

1. Термостат, программмируемый для проведения ПЦР-анализа "ВСМ" (рекомендован к применению в медицинской практике Минздравом РФ), — прибор для проведения амплификации (умножения) детекти­руемого участка генома возбудителя заболеваний. При­бор рассчитан на одновременный анализ 24 образцов (из которых один положительный и один отрицатель­ный контроль) клинического материала.

2. Термостат 2Т001 ("ВСМ") — предназначен для термостатирования биологических проб.

3. Настольная миницентрифуга (Элми) — предна­значена для подготовки проб исследуемого клиниче­ского материала. Обеспечивает максимальную частоту вращения ротора 14 000 об/мин.

4. Микроцентрифуга-вортекс МВ01 ("ВСМ") — предназначена для низкооборотного центрифугирова­ния и ресуспендирования биологических проб.

5. Источник питания низковольтный "ИП-01" ("ВСМ") — предназначен для серийного анализа биоло­гических образцов при помощи электрофореза при двух фиксированных значениях напряжения.

6. Камера для электрофореза КЭ-01 ("ВСМ") — предназначена для проведения исследования биомеди­цинских проб методом электрофореза в агарозном геле.

7. Трансиллюминатор ТР-01 ("ВСМ") — источник ультрафиолетового излучения, предназначен для иссле­дования люминесцирующих следов в жидкостях и ге­лях.

В состав набора входят микродозаторы, подставки и коробочки для пробирок типа Эппендорф. Возможно комплектование диагностических центров любым оте­чественным и зарубежным оборудованием, программи­руемый термостат может снабжаться стабилизатором, а трансиллюминатор фотоаппаратом или монитором, компьютером для архивации результатов. ЗАО "ВСМ" обеспечит Ваших специалистов необходимыми методи­ческими материалами, проводит консультирование по лицензированию и интерпретации полученных резуль­татов. Одной из основных задач мы видим в пропаганде возможностей метода, внедрение его в сегодняшних не­простых условиях в медицинскую практику. В России и странах СНГ уже работают десятки лабораторий, по­ставленных ЗАО "ВСМ".

Суммируя преимущества использования тест-сис­тем на основе метода ПЦР, необходимо отметить:

1. Метод позволяет обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы в тех случаях, когда други­ми способами это сделать невозможно.

2. Для диагностики практически всех известных в настоящее время заболеваний может быть использован один набор приборов и незначительно отличающиеся для разных инфекций наборы реактивов, что обуслов­лено химическим сродством нуклеиновых кислот. По­является возможность создания для многих биологиче­ских жидкостей и возбудителей создания универсальной процедуры приготовления пробы, выделения ДНК и постановки реакции.

3. Отпадает необходимость в средах, клеточных культурах, узкой специализации медицинского персо­нала. ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно реагирующими ан­тигенами.

4. Возможен анализ серонегативных пациентов на самых ранних стадиях инфекционного процесса, когда лечение наиболее эффективно.

5. Легко определяются патогенные возбудители, для которых не разработаны или затруднены методы куль­тивирования, а также для персистирующих форм пато­генных бактерий.

6. Метод позволяет поставить надежный диагноз в течение рабочего дня, т. е. за 6—8 ч.

7. Метод обладает высокой чувствительностью (до 1—5 копий возбудителя в пробе) и специфичностью (различают серологические штаммы).

8. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы: обычно несколько микролитров.

9. Возможна одновременная диагностика несколь­ких возбудителей заболеваний в одной пробе.

10. Стоимость одного анализа при использовании отечественных приборов и реактивов сопоставима со стоимостью одного анализа иммуноферментным мето­дом.

В настоящее время ученые разных стран мира при­лагают усилия для дальнейшего развития метода ПЦР:

упрощения и автоматизации анализа, возможности синтеза больших фрагментов нуклеиновых кислот, рас­ширения приложений метода.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) имеет крайне высокую аналитическую чувствительность и позволяет идентифицировать патогенные микроорганизмы на любом филогенетическом уровне. Это обусловило его широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний с/х животных. В то же время высокая 'чувствительность метода при неправильном его использовании может привести к снижению специфичности ПЦР-анализа. Главной проблемой здесь является случайный перенос (контаминация) следовых количеств ДНК активной в ПЦР (специфических продуктов амплификации ДНК - «ампликонов», положительного контрольного образца, ДНК клинического образца, содержащего возбудитель) в реакционную пробирку, не содержащую возбудитель и как следствие появление ложноположительных результатов ПЦР.

Сотрудники практической ПЦР-лаборатории в своей работе сталкиваются с двумя основными видами контаминации:

1) перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов;

2) контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

Необходимо также указать еще на две, часто встречающиеся, Причины контаминации. Одна из них связана с тем, что вблизи или даже в самом помещении, предназначенном для ПЦР, производится параллельная микробиологическая диагностика одноименных возбудителей инфекций или оба вида анализа выполняются одними и теми же сотрудниками. При этом контаминирущим материалом может стать ДНК, получаемых в больших количествах в процессе микробиологического наращивания возбудителей.

В научно-исследовательских учреждениях, занятых в разработке ПЦР-методик или организациях производящих ПЦР-тест-системы к вышеперечисленным источникам контаминации, может добавится контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагменты генов мишеней для ПЦР, изготовляемых в качестве положительных контрольных образцов.

Среди всех вариантов контаминации наиболее часто встречающимся является контаминация «ампликонами» посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или поверхности кожи сотрудников лаборатории, что приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Как правило, выявление; источника контаминации представляет, собой трудоемкую задачу, требующую- затрат времени и средств.

Накопленный к настоящему моменту опыт работы ведущих лабораторий ПЦР-дигностики инфекций позволяет сформулировать основные требования к планировке помещений и правила проведения самих анализов. Строгое соблюдение данных требований значительно снижает риск контаминации и получения ложноположительных результатов.

Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностичвских лабораторий

1). Лаборатория должна быть разделена на зоны или комнаты для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат:

- ПЦР-помещение, где выделяются Зона 1 - для проведения обработки клинических образцов и Зона 2 - для приготовления реакционной ПЦР-смеси и внесения выделенных проб ДНК (при наличии условий Зону 1 и Зону 2 рекомендуется организовать в разных комнатах);

- в ПЦР-помещений запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

- пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации;

- в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от ПЦР-помещений.

3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в ПЦР-помещения.

4). Обработка клинических образцов должна производиться в ламинарном шкафу или настольном ПЦР-боксе, снабженном ультрафиолетовыми лампами.

5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящиеся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.

7). Следует однократно использовать перчатки как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР.

8). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

9). Целесообразно использовать наконечники для автоматических пипеток аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку.

10). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов.

11). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов.

12). Не следует использовать водяные бани, так как заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источников контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты.

13). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп, работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами 1-II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М.,1980.

14). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:

- каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы.

- при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя).

- следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы с целью борьбы с пылью.

15). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей которые диагностируются данной лаборатории.

16). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение.

Требования к проведению ПЦР-анализа

Обработка клинических образцов

1). Забор клинических образцов необходимо производить только одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробив предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщател промытые дистиллированной водой и прокаленные.

2). Работать только в одноразовых перчатках.

3). Необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматичес пипеток с аэрозольным барьером.

4). Обязательно менять наконечники при перехода от одной пробы к другой

5). Использованные пробирки и наконечники повторно не используются, должны сбрасываться в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с раствором соляной кислоты.