Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Краткие теоретические сведения. РКЭ вначале овоскопируют, на скорлупе отмечают границу воздушной камеры

РКЭ вначале овоскопируют, на скорлупе отмечают границу воздушной камеры. Её поверхность обрабатывают спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2...3 мм выше границы воздушной камеры, Разрывают подскорлупную и хорион-аллантоисную оболочки, асептически извлекают эмбрион и помещают его в чашку Петри. Затем у эмбриона удаляют лапки, крылья, голову и обязательно внутренние органы. Оставшуюся часть (кожно-мышечный мешок) промывают буферным раствором Хенкса с антибиотиками. После трехкратного отмывания эмбрион измельчают ножницами на кусочки размерами 2...3 мм. Измельченную ткань 3 раза отмывают в растворе Хенкса с антибиотиками от слизи и элементов крови и переносят в колбу для трипсинизации. Ткань в колбе заливают двойным объемом 0,25%-ного раствора трип­сина, подогретого до 37 °С, и вносят стериль­ный магнит. Колбу ставят на магнитную ме­шалку. Раствор трипсина и механическое воздействие вращающегося магнита способствуют растворению межкле­точного вещества, разделению клеток и пере­ходу отдельных из них в раствор. Первый этап трипсинизации продолжается 3...5 мин. Затем отделившиеся клетки вместе с трипси­ном сливают в центрифужные пробирки и помещают в кювету со льдом, чтобы ограни­чить дальнейшее воздействие трипсина на клетки. К оставшейся ткани добавляют вто­рую порцию трипсина, и колбу снова поме­щают на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не наступало вспенивания содержимого колбы. Трипсинизацию проводят 3-4 раза, до полного истощения ткани, кото­рое определяют по белесоватому оттенку кусочков и их разбуха­нию. После окончания трипсинизации полученную взвесь клеток 10...15 мин подвергают центрифугированию при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспензируют в питательной среде (1:10), подогретой до 37 °С, и сливают в колбу через 3-4 слойный марлевый фильтр. После перемешивания суспензии клеток берут две ее пробы по 0,5 мл. К каждой из них добавляют по 0,5 мл 0,1%-го кристаллвиолета в 0,1 N растворе лимонной кислоты. После перемешивания каплю суспензии помещают в счетную камеру Горяева и подсчитывают клетки, имеющие хорошо заметное ядро и неповрежденную ци­топлазму. Клетки подсчитывают не менее как в трех больших квадратах камеры. Из полученных данных находят среднее арифметическое. Количество клеток в 1 мл определяют по фор­муле

а х 4000 х б

Х = --------------------

в

где а — среднее количество клеток в малом квадрате; б — степень разведения; в — количество подсчитанных малых квадратов.

Точный подсчет клеток необходим, поскольку качественный монослой можно получить лишь при определенной оптимальной посевной дозе. В соответствии с результатами подсчета к суспензии добавляют необходимое количество питательной среды, чтобы в 1 мл содержалось 250...300 тыс. клеток. К пи­тательной ростовой среде добавляют 10% бычьей сыворотки и антибиотики — пенициллин, стрептомицин, тетрациклин (по100ЕД/мл), устанавливают рН 7,2...7,4.

Для культивирования клеток в каждую пробирку засевают 1-15 мл суспензии; во флаконы емкостью 100 мл — 20 мл, 250 мл— 40 мл, 1л — 100 мл клеточной взвеси. Флаконы и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками.

На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх ящики с наклонным дном (угол 6°) и помещают в термостат при 37 °С.

Клетки фиксируются на внутренней поверхности пробирки. Через 24...48 ч образуется сплошной слой клеток, располагающихся 1 один ряд (монослой).