Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Краткие теоретические сведения. Одним из методов получения перевиваемых клеток являет­ся отбор клеток первичной культуры с повышенной активностью роста

Одним из методов получения перевиваемых клеток являет­ся отбор клеток первичной культуры с повышенной активностью роста. Отбор осуществляют при регулярной смене среды. Для поддержания отобранных клеток в жизнеспособном состоянии, питательную среду каждые 3...4 дня заменяют свежей. Обычно работа по получению перевиваемых клеток продолжается в тече­ние многих месяцев.

В результате подбора специальных питательных сред, ре­жима культивирования удается адаптировать отдельные клетки к определенной питательной среде и перевивать их очень долго. Клетки, которые приобрели способность к длительному пассированию вне организма, получили название перевиваемых. Таким образом, перевиваемые клетки — это такие клетки, которые перевиваются из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды с сохранением потенциальной возможности к дальнейшему размножению.

К перевиваемым клеткам из нормальных тканей относят: штамм L (мышиные фибропласты, 1943), СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус, 1957), С-18 (из эмбриональной почки поросенка, 1960), ФК (фибробласты крысы, 1954) и др.

Перевиваемые клетки из опухолевой ткани включают: НеLа (клетки рака шейки матки женщины, 1952), Нер-2 (клетки кар­циномы гортани человека, 1955), Нер-3 (клетки лимфоиднов карциномы человека, 1955) и др.

Разновидностью перевиваемых клеток являются диплоидные клетки. Это морфологически однородные культуры, стабили­зированные в процессе культивирования in vitro, имеющие ограниченный срок жизни (не более 50 пассажей), сохраняющие правильный диплоидный набор хромосом, свойственный исход­ной ткани, свободные от посторонних вирусов и микробов и не обладающие онкогенной активностью.

Необходимо отметить, что для некоторых зоопатогенных вирусов наиболее употребимы определенные виды перевиваемых клеток (табл.2), например, ВНК-21 для вируса ящура, РК-15— для вируса чумы свиней, диареи крупного рогатого скота, ПЭК - для вируса ринотрахеита, ТБ — для вируса герпеса и т.д. Поэто­му ряд видов культур клеток надо уметь сохранять в условиях лаборатории. Основным способом длительного сохранения пере­виваемых клеток является их глубокое замораживание (до минус 70 °С) в присутствии глицерина, сыворотки крови с последую­щим хранением ампул в жидком азоте (минус 196 °С). Все это способ­ствует длительному (до 5...6 месяцев) сохранению клеток.

Перевиваемые клетки имеют следующие преимущества пе­ред первично-трипсинизированными:

1. Они обычно не загрязнены посторонней микрофлорой, как это часто наблюдается в первичных культурах.

2. Большинство их обладает более широким спектром чув­ствительности к вирусам, чем соответствующие первичные куль­туры. Это зависит от происходящих в них физиологических из­менений.

3. Для изготовления перевиваемых клеток требуется мень­ше средств и труда по сравнению с приготовлением первичных культур.

4. Эти клетки чаще, чем первичные культуры, используют­ся для выделения вирусов из материалов, содержащих бактерии, поскольку менее чувствительны к высоким концентрациям анти­биотиков (результат адаптации при пассировании в питательной среде с антибиотиками).

5. Для перевиваемых клеток характерна вирусологическая стерильность (отсутствие спонтанного вирусоносительства).

Вместе с тем, перевиваемые клетки имеют и ряд недостат­ков, которые в известной степени ограничивают их применение. Они склонны к малигнизации, т.е. злокачественному перерожде­нию, независимо от происхождения, требуют постоянного пассирования с использованием свежей среды, подвержены неспецифической дегенерации (изменяется морфология и снижается чувствительность к вирусам).

Таблица 3.

Характеристика основных свойств перевиваемых линий клеток, полученных из органов различных животных

Перевивание клеток производят в следующем порядке:

1. Снятие клеточного монослоя. Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путем (соскабливанием). Однако, это грубый прием, ведущий к значительному повреждению клеток. Чаще применяют 0,02%-ный раствор версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов, в частности магния и кальция, т.е. тех ионов, которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки отделяются от стекла, округляются и образуют взвесь. Из сосудов с развившимся клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют 0,5...1 мл подогретого до 37° (раствора версена и выдерживают в термостате 20...30 мин при периодическом покачивании.

2. Отделение клеток. Взвесь клеток в версене помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800...1000 об/мин в течение 7...10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Подсчет клеток проводят в камере Горяева так же, как и при получении первичных культур.

3. Посев клеток. После подсчета исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации. Приготовленную взвесь вносят при помешивании на магнитной мешалке или пипетированием в пробирки или матрасы и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток 1 пробирки 80... 100 тыс/мл, матрасы, флаконы — 25...30 тыс/мл. На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту (чертой кладут вверх), засеянные клетки культивируют в термостате при 37 °С в течение 3...4 суток до образования сплошного монослоя. Полученный монослой сохраняет при 37 °С жизнеспособность в течение 5...10 суток в зависимости от вида клеток и состава питательной среды. В течение этого срока клетки можно отделить от стекла, подвергнуть транспортировке или использовать для длительного хранения.

Транспортируют клеточные культуры чаще всего авиапочтой в герметически закрытых сосудах. При этом следует избегать резких колебаний температуры, особенно замерзания или перегревания. По мере старения клеток производят пассаж - переносят их в пробирки со свежей питательной средой.

Заражение культуры клеток. Для заражения вируссодержащим материалом отбирают пробирки с наличием сплошного клеточного монослоя, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Питательную среду удаляют, и в каждую пробирку вносят по 0,1...0,2 мл вируссодержащего материала, подлежащей исследованию, и оставляют ее в наклонном положении. После 30...60 мин контакта материала с клетками в пробирки добавляют1…1,5 мл поддерживающей (без сыворотки) среды. Для каждой пробы вируссодержащего материала используют не менее четырех пробирок (4-6) с культурой клеток. Каждое исследование сопровождают контролями:

а) контроль монослоя в норме (4-6 пробирок). В этом случае из пробирок удаляют ростовую питательную среду и заменяют ее поддерживающей;

б) контроль монослоя, инфицированного эталонными штам­мами вирусов (4-6 пробирок). При этом пробирки с культурой клеток заражают известными (эталонными) вирусами;

в) контроль монослоя, контактировавшего с экстрактом аналогичной ткани, не зараженной вирусом. Для этого берут не­зараженную ткань, аналогичную той, где предполагается наличие вируса. Из нее готовят материал и заражают 4-6 пробирок с культурой клеток.

Все пробирки помещают в ящик с наклонным дном (угол 6°) так, чтобы монослой оказался под питательной средой (чертой вверх) и инкубируют в термостате при 37 °С. Клетки ежедневно микроскопируют под малым увеличением микроскопа (объектив х8 или х10), сравнивая культуры, зараженные вирусом, с кон­трольными.

Формы ЦПД. При взаимодействии вирусов с клетками в по­следних наблюдаются различные морфологические изменения, которые обусловливаются рядом факторов, особенно степенью чувствительности клеток культуры к вирусу и условиями среды.

Контакт вирусов с восприимчивыми клетками сопровожда­ется острой или латентной инфекцией и неопластической транс­формацией последних. При инфекции отмечаются деструктивные изменения в зараженных клетках, часто приводящие к их гибе­ли. Все морфологические изменения, возникающие под воздейст­вием вируса, называют цитопатическим действием (эффектом), сокращенно ЦПД (ЦПЭ). При латентной инфекции репродукция вируса в зараженных клетках не приводит их к гибели, и внешне они не отличаются от нормальных (не зараженных).

Первоначальный этап взаимодействия вирусов с клеткой — это изменение некоторых звеньев обмена веществ, которые можно выявить определенными гистохимическими реакциями. Одним из ранних проявлений такого взаимодействия является увеличение размеров ядра (дезинтегративное набухание). Эта реакция неспе­цифична, поскольку она не зависит от биохимического состава и размера вирусов, их биологических свойств. Данное явление ха­рактерно для вирусов, вызывающих как острую, тек и хрониче­скую инфекцию.

Второй этап — специфический. Одна из его особенностей — проявление характерного ЦПД вируса. При этом некоторые виру­сы (аденовирусы и др.) поражают ядра клеток, другие — цитоплазму (вирус гриппа и др.), третьи же разрушают и ядро, и цитоплазму.

При исследовании под микроскопом клеточного монослоя отмечают следующие морфологические изменения при остров инфекции:

а) округление клеток. Они принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жид­кости;

б) появление в цитоплазме пораженных клеток мелкой зер­нистости;

в) увеличение в размерах этой зернистости и появление внутриклеточных включений;

г) очаговые скопления округлившихся клеток в виде гроз­дьев винограда;

д) образование гигантских многоядерных клеток — симпластов, синцитиев;

е) появление в монослое клеток "стерильных пятен", т.е. участков без клеток;

ж) полное "сползание" клеток со стекла.

При латентной инфекции вирус в клетках размножается, но не вызывает их видимого разруше­ния. Клетки остаются жизнеспо­собными, однако интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется их морфоло­гия.

При неопластической трансфор­мации у пораженных клеток образуются плотные фо­кусы трансформации различной величины и формы белого цвета.