Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Применяют 2 способа заражения.

1. С выросшего монослоя в пробирках сливают ростовую питательную среду, клеточный слой ополаскивают раствором Хенкса для удаления белка питательной среды и продуктов клеточного обмена. Затем в КК наливают 0,8мл вируса или рабочей суспензии.

4-6 пробирок с КК оставляют для контроля, где только заменяют питательную среду.

Зараженные и контрольные пробирки с КК помещают в термостат при температуре +37°С.

2. Сливают ростовую питательную среду. На клеточный слой наносят исследуемый материал или вирус. Плотно закрывают резиновыми пробками и выдерживают 1-2 часа на контакте. За это время вирус адсорбируется на поверхности клеток и частично проникает внутрь клеток. Затем монослой промывают раствором Хенкса, сливают жидкость вместе с продуктами клеточного обмена и не адсорбированным вирусом. В каждую пробирку наливают по 1мл поддерживающей питательной среды, плотно закрывают пробками, укладывают в горизонтальный штатив под углом 5-6° и ставят в термостат на инкубацию.

Ежедневно проводят микроскопию КК на выявление ЦПД. Микроскопию всегда начинают с контрольных КК.

Наиболее широко применяют стационарное инкубирование в термостате при 37 °С. При этом матрасы кладут в горизонтальном положе­нии, пробирки - под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий заражен­ные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе - рол­лерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.

Наиболее широко и часто о размножении вируса в куль­туре клеток судят по цитопатическому (цитопатогенному) эффекту или цитопати­ческому (цитопатогенному) действию.

Американский ученый Хуанг в 1945 году объединил все дегенеративные изменения в пораженной вирусом клетке под общим названием ЦПД или ЦПЭ (цитоплазменное действие вируса или цитоплазменный эффект).

ЦПД называются любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса.

ЦПД - это морфологические и функциональные изменения в культуре клеток под действием вируса, т.е. дегенерация, перерождение разрушение и гибель клетки.

Физиологические изменения клеток установить довольно слож­но, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, исполь­зуя малое увеличение (объектив х8-10, окуляр х7-10), осмот­реть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с та­кими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп от­личия зараженной культуры клеток от контрольной можно счи­тать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь мо­нослой или отмечаться только в виде небольших очажков изме­ненных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена ви­русом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если измене­нию (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в про­бирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если ³/₄ - на три, если1¤2 - на два креста, 1¤₄ - на один крест. Но эти оценки все же весьма условны.

Нельзя допускать дегенерации всех клеток монослоя, т.к температура термостата (+37°С) инактвирует значительную часть освободившегося вируса в культуральной жидкость. Выраженные поражения 50% клеток монослоя свидетельствуют об активной репродукции вируса во всех клетках. Зараженные пробирки или матрацы энергично встряхивают, клетки разрушаются, вирус заходит в питательную среду, которая называется культуральная жидкость.

Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида кле­ток, дозы заражения, условий культивирования и т.д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2-3 сут. после заражения (энтеровирусы), другие - через 1-2 нед. (аденовирусы).

Ряд авторов пытались сгруппировать сходные формы ЦПД. У од­них получилось 23 формы, у других - 11, У третьих - 5 и т.д. Но наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование.

Фрагментация - разрушение клеток на отдельные фрагменты, ко­торые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).

Округление - потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, при­нимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плава­ют в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, адено­вирусы и др.).

Симпластообразование - растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по пери­ферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием виру­са или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цито­плазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот ме­тод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широ­ко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы сви­ней некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.) Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность кле­точного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.

Таким образом, ЦПД - это погибающие или погибшие клетки под действием вируса. Такие же дегенеративные процессы под действием вируса проходят и в клетках больных животных и людей.

Классификация ЦПД по Эндерсу включает 3 типа дегенерации в клетках.

1-й тип-набухание и округление инфицированных клеток с последующим появлением в них их цитоплазме выраженной зернистости, за счет фрагментации ядра и скопления продуктов нарушенного клеточного обмена. Затем эти клетки разрушаются.

2-й- образование цитоплазматических и внутриядерных включений с последующим разрушением клеток.

3-й- характеризуется образованием гиганских многоядерных клеток симпластов, за счет слияния нескольких разрушенных клеток с цитоплазматическими и внутриядерными включениями.

Один вирус может вызвать дегенерацию клеток по 1 типу, другой по 2 типу и т.д. Эти изменения настолько характерны, что становится возможным не только определить наличие вируса в клетке, но и до некоторой степени судить о принадлежности вируса к тому или другому семейству.

Профессор Анджепаридзе внес существенные дополнения в оценку ЦПД, уточнил и детализировал этапы дегенеративных изменений в пораженных вирусом клетках.

1.Набухание и округление клеток.

2.Появление в цитоплазме мелкой зернистости.

3.Появление в цитоплазме крупной зернистости.

4.Выпадение пораженных клеток из монослоя.

5.Фрагментация ядра.

6.Распад клеток образованием гиганских многоядерных клеток за счет слияния отдельных разрушенных клеток.

7.Отсутствие видимых дегенеративных изменений в клетках(латентная вирусная инфекция).

При неопластической трансформации пораженных клеток в мо­нослое образуются плотные фокусы трансформации различной ве­личины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).

Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к «слепым» пассажам. Необходимо провести не менее трех «слепых» пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.

ЦПД используется для:

1.Обнаружения вируса в исследуемом материале.

2.Титрация или количественного определения вируса (ЦПД 50).

3.Определения титра специфических антител в исследуемых сыворотках крови по реакции нейтрализации. (РН).

Однако есть вирусы, которые вызывают латентную (скрытую) вирусную инфекцию в клетке. Они размножаются в клетках, но видимой дегенерации в клетках при световой микроскопии обнаружить не удается. ЦПД или запаздывает или отсутствует. Для обнаружения таких вирусов в культурах клеток применяют люминисцентную вирусоскопию или ставят реакцию гемадсорбции (РГАд).

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ:

1. 1.Студенты знакомятся с оборудованием бокса.

2. Студенты знакомятся с методами заражения культур клеток вирусом.

3. Студенты проводят микроскопию погибших зараженных культур клеток.

4. Студенты знакомятся с методами заражения культур клеток вирусом.

5. Студенты проводят микроскопию нормального монослоя культур клеток.

6. Студенты оценивают ЦПД монослоя культур клеток под действием вируса.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1. Как проводят подбор культур клеток для заражения их вирусом?

2. Каковы методы заражения культур клеток вирусом?

3. Какие культуры клеток используют при нкубировании определенных вирусов?

4. Что такое ЦПД вируса?

5. Каковы изменения в монослое клеток под действием вируса?

6. Как оценивается ЦПД вирусов?

ЛИТЕРАТУРА

а) основная литература

1. Белоусова, Р.В.Ветеринарная вирусология: Учеб. [для вузов] / Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская, И.В. Третьякова.– М.: КолосС, 2007. – 423 с.

2. Белоусова, Р.В. Практикум по ветеринарной вирусологии / Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская, И.В. Третьякова. – М.: КолоС, 2006. – 248 с.

3. Госманов, Р.Г. Ветеринарная вирусология / Р.Г. Госманов, Н.М. Колычев, В.И. Плешакова – С.-П.: «Лань», 2010. - 480 с.

4. Тихонов, И.В. Биотехнология: Учебник / Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева, А.Я. Самуйленко, В.А. Гаврилов. – СПб: Гиорд, 2005. – 780 с.

5. Тихонов, И.В. Практикум по биотехнологии: Учебно-методич. пос.

/ В.А. Гаврилов, Д.А. Девришов и др. – М.: Изд-во «Киселева Н.В.», 2010. – 330 с.

б) дополнительная литература

1. Дорофеев, В.И. Использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики инфекционных заболеваний. Учебно-методическое пособие / В.И. Дорофеев, Веревкина М.Н., Светлакова Е.В, Ожередова Н.А. – Ставрополь «АГРУС», 2008. – 32 с.

2. Дорофеев, В.И. Методы иммуноферментного анализа и применение их в вирусологических исследованиях. Методические указания / В.И. Дорофеев, Веревкина М.Н., Светлакова Е.В, Ожередова Н.А. – Ставрополь «АГРУС», 2008. – 36 с.

3. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия / С.Н. Щелкунов. Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. – 496 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Занятие 1. Знакомство с работой и оборудованием вирусологической лаборатории. Техника безопасности при работе с вирусами. Схема вирусологических исследований……………………

Занятие 2. Отбор, консервирование и транспортировка патологического материала. Приготовление рабочей суспензии. Методы очистки и концентрации вирусов в исследуемом материале.

Занятие 3. Световая вирусоскопия.

Занятие 4. Люминесцентная вирусоскопия и методы флуорохромирования препаратов.

Занятие 5. Электронная вирусоскопия

Занятие 6. Культивирование вирусов в организме лабораторных животных. Культивирование вирусов в эмбрионах кур. Схема эмбрионов кур. Освоение методов заражения эмбрионов кур.

Занятие 7. Отбор вирусосодержащего материала от погибших эмбрионов кур и дальнейшая работа с вирусосодержащим материалом.

Занятие 8. Культивирование вирусов на культуре клеток.

Занятие 9. Методы заражения культур клеток. Цитопатогенное действие вируса на клетку.

ЛИТЕРАТУРА