Читайте также:
|
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ:
- Люминесцентный микроскоп;
- готовые препараты для люминесцентной микроскопии;
- предметные и покровные стекла;
- бактериальные петли;
- стерильные пастеровские пипетки;
- спиртовки;
- исследуемый вируссодержащий материал;
- набор флуорохромов;
- раствор Хенкса;
- 96º этиловый спирт;
- термостат.
Люминесценция - холодное свечение. Явление люминесценции сводится к излучению веществами света за счет ранее поглощенной энергии. Явление люминесценции известно давно. Изучение люминесценции началось около 300 лет назад. В настоящее время различают рентгенолюминесценцию, электролюминесценцию, фотолюминесценцию и т.д. Явление люминесценции объясняется законом Стокса: «При люминесценции спектр излучения сдвинут по отношению спектра поглощения в сторону более длинной волны». Не всякое облучаемое тело способно светиться. Свечение ранее облученных тел можно объяснить следующими физическими законами.
Под воздействием источника света тело получает дополнительно определенный квант энергии света, при этом электроны начинают вращаться с огромной скоростью, некоторые, отрываясь от своих орбит, переходят на
более высокие орбиты, а потом они могут вернуться на свои орбиты. В
момент перехода электронов с одной орбиты на другую, освобождается
энергия, т.е. сила, удерживающая электрон на своей орбите, атом испускает определенный квант энергии (света), сумма освобожденной энергии
превращается в световой поток и тело начинает светиться.
В биологии глубокое изучение метода люминесцентного анализа проводится с 1945 года, когда американский ученый Кунст предложил использовать в гистологии метод люминесцирующих антител. В микробиологии и вирусологии методы люминесцирующих антител стали применяться для обнаружения вируса в исследуемом материале и его идентификации с 1955 года (Кузьмин, Поляков, Мейсель, Михайлов и др.).
Метод люминесцирующих антител в люминесцентной микроскопии является наиболее перспективным, т.к. является экспресс методом диагностики различных бактериальных и вирусных болезней людей, животных, растений. Люминесцирующие тела представляют собой иммунные глобулины, меченные флуорохромами. Отечественная промышленность выпускает более 30 различных флуорохромов-люминесцентных красок (люминофоров), но не все они пригодны для мечения антител. В России наиболее часто применяются изоционат флуоресцеина или изотиоционат флуоресцеина, дающий зеленую флуоресценцию, изоционат родамина В или изотиоционат родамина В - оранжевая флуоресценция, и некоторые другие красители. Реже применяют алфадиметилесульфохлорид, дающий слабое желтое свечение.
В современных люминесцентных микроскопах люминесценция исследуемых препаратов вызывается, как правило, ультрафиолетовыми лучами ближнего спектра, а также фиолетовыми и синими, имеющими наименьшие длины волн по сравнению с другими лучами.
Рис. 1. Общий вид люминесцентного микроскопа «Люмам Р-2»:
1 – бинокуляр; 2 – объективы; 3 – предметный столик; 4 – кожух осветительной лампы;
5 – основание.
Оптическая схема современного люминесцентного микроскопа сводится к следующему: лучи от источника света (ртутно-кварцевая лампа) проходят через коллектор и ирис диафрагму, затем попадают в систему светофильтров, где фильтры СЗС (сине-зеленый свет) отсекают инфракрасные лучи, БС-УФЛ, ФС - все лучи видимого спектра, кроме синих и фиолетовых. Дальше синие и фиолетовые лучи (частично УФЛ) проходят ряд собирающих линз и попадают на светоделительную пластинку, которая направляет их через объектив на исследуемый препарат. Эти лучи, отразившись от препарата, проходят через объектив до светоделительной пластинки, но они не проходят через нее, а возвращаются к источнику света. Свет же люминесцирующего объекта, как имеющий более длинную волну (по закону Стокса), свободно проходит через светоделительную пластинку и попадает в окуляр. В таком случае исследователь видит в поле зрения светящийся объект.
Флуорохромирование - это обработка препарата флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения препарата.
Отечественная промышленность выпускает специальные наборы флуорохромов. Наиболее широко применяется акридиновая группа (акридин оранжевый, акридин желтый и др.) и тиозиловая группа (мримулин). Флуорохром чаще всего используют в водных растворах очень низкой концентрации (от 1: 1000 до 1: 1 000 000). Метод флуорохромирования может быть использован при изучении некоторых вирусов (оспы, болезни Борна, аденовирусной инфекции и др.).
Наибольший интерес представляет акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует желто-зеленым цветом, а рибонуклеиновая кислота – рубиново-красным.
Препараты для метода флуорохромирования можно готовить двумя способами:
а) на свежий мазок-отпечаток (из органов, соскобов со слизистых оболочек) или суспензии инфицированных клеток наносят1-2 капли рабочего раствора (1:10 000) акридинового оранжевого, накрывают покровным стеклом. Приготовленный таким образом свежий (в течение 10-20 мин после его приготовления) препарат рассматривают в люминесцентном микроскопе;
б) мазки-отпечатки, полученные из патологического материала, или инфицированные культуры клеток (на покровных стеклах) фиксируют 96°-ным этиловым спиртом в течение 15-30 мин, промывают раствором Хенкса, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридинового оранжевого (1:10 000), через 5-10 мин накрывают покровным стеклом и исследуют.
В результате окрашивания ДНК, содержащаяся в ядрах клеток, дает изумрудно-зеленое свечение, РНК, находящаяся в цитоплазме, светится красным или оранжевым цветом. В препаратах ДНК-содержащих вирусов, например аденовируса, вирусный материал светится зеленым цветом в ядре в виде гранул различной величины. При наличии в препарате РНК-содержащего вируса, например, вируса гриппа, вирусный материал обнаруживается в виде ярко-красных гранул в цитоплазме клеток.
Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное), применяют обработку препаратов 0,5%-ным раствором РНК-азы или ДНК-азы в течение 5-10 мин или облучение УФ-лучами. При этом свечение клеточных РНК или ДНК сразу исчезает, а вирусные продолжают светиться еще 20-30 мин. Это служит доказательством специфичности вирусных нуклеиновых кислот.
Метод простого флуорохромирования несложен, однако и большинстве случаев он не дает возможности полно дифференцировать возбудителей болезней.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ:
1. Студенты изучают устройство люминесцентного микроскопа.
2. Студенты знакомятся с набором флуорохромов.
3. Студент микроскопируют готовые мазки, окрашенные флуорохромами.
4. Студенты готовят и микроскопируют мазки, окрашенные флуорохромами.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Что такое явление люминесценции?
2. Каков закон Стокса, объясняющий явление люминесценции?
3. Каким образом работает люминесцентный микроскоп?
4. Что и как изучают в люминисцентный микроскоп?
5. Какие применяются флуорохромы?
6. Что такое флуорохромирование?
7. Для каких целей проводится флуорохромирование?
8. Каковы методы флуорохромирования?
Дата добавления: 2014-12-20; просмотров: 183 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав |