Студопедия  
Главная страница | Контакты | Случайная страница

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Метод определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (косвенный метод).

Читайте также:
  1. A) Метод обучения.
  2. A) Новый метод мониторинга доказал свою надежность.
  3. A) определение спроса на товар, оценка издержек производства, выбор метода ценообразования, установление окончательной цены
  4. A. метод абсорбции
  5. B. Основные приложения метода координат на плоскости.
  6. C) Методы исследования
  7. C.) К специфическим задачам, которые используются в ходе реализации частично-поисковых методов на уроке технологии, относятся
  8. D)практических методов.
  9. Hs-СРБ – высокочувствительный метод измерения концентрации СРБ.
  10. I. Назначение методических рекомендаций

Метод специфической рестрикции ДНК (блот-гибридизации (блоттинг) по Саузерну).

Необходимым этапом в молекулярно-генетической диагностике является рестрикция ДНК на фрагменты. Этот процесс осуществляется рестриктазами, относящимися к группе бактериальных эндонуклеаз. В генетике человека используется несколько десятков различных рестриктаз. Основным свойством рестриктазы является узнавание специфического для нее места в последовательности нуклеотидов и способности разрезать нить ДНК в этом локусе на 4-6 пар оснований. При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор различной длины. Если повреждение гена (мутация) изменит какой-нибудь из этих локусов, это повлечет за собой изменение числа и размеров гибридизируемых с меченым зондом фрагментов. Примерно 50% нуклеотидных замен приводит к изменению места рестрикции, благодаря чему и возможна прямая детекция мутаций на основе рестриктного анализа.

Эта методика применяется для диагностики серповидноклеточной анемии, талассемий, умственной отсталости с ломкой Х-хромосомой, фенилкетонурии, миопатии Дюшена и других заболеваний.

Метод определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (косвенный метод).

Применение специфических рестриктаз эффективно и в тех случаях, когда неизвестна структура мутантного и нормального аллелей гена, повреждение в котором ответственно за патологию. Может быть неизвестной и локализация этого гена, но установлено, что интересующая нас мутация сцеплена с определенным фрагментом ДНК (или ассоциирует с ним), обусловливая лишь полиморфизм генетического материала. Локус узнавания для рестриктазы находится не в интересующем нас гене, а рядом. Само изменение этого локуса не вызывает патологии (возможно, не затрагивает значащего участка ДНК), обусловливая лишь полиморфизм генетического материала.

Например, в обследуемой семье искомая мутация сцеплена с определенным по длине ферментом и наследуется вместе с ним. Диагноз в данном случае проводится с использованием метода специфической рестрикции ДНК, то есть в качестве зондов используются олигонуклеиды, комплементарные к таким незначащим полиморфным последовательностям, а не к искомому гену (ведь его структура не известна), и диагностическое значение будет иметь только изучение информативной семьи. Для такой семьи, в которой обследованы пробанд, его родители и здоровые сибсы устанавливается наличие сцепления искомой мутации с одним из полиморфных локусов. Если это установлено, то в данной семье возможна последующая пренатальная диагностика заболевания. Следует отметить, что само по себе обнаружение ПДРФ не свидетельствует о патологии. На это будет указывать наличие характерного ПДРФ у пробанда (в большинстве случаев в гомозиготном состоянии) и у родителей (в гетерозиготе). Недостатком данного метода является необходимость предварительного изучения генотипа (гаплотипа) хотя бы одного пораженного родственника. В случае отсутствия пораженных родственников, «доступных» для обследования, проведение диагностики становится невозможным.

Этот метод может быть использован для диагностики широкого спектра наследственных болезней, так как для него не нужны знания структуры гена и характера мутаций. До 1989 года определение ПДРФ эффективно использовалось в диагностике миопатии Дюшена, муковисцидоза, фенилкетонурии и более чем 100 наследственных болезней.

Недостатками этих методов, является необходимость:

1) относительно большого количества ДНК и 2) радиактивно меченых олигонуклеотидов в качестве зондов, что затрудняет проведение диагностики в лечебных учреждениях. Эти методы дорогостоящие, трудоемкие и требуют высокой квалификации кадров.

Вместе с тем, последний из описанных подходов (ПДРФ) оказался чрезвычайно продуктивным в научных исследованиях: знание тесно сцепленного с геном ПДРФ-маркера позволило локализовать неизвестный ген на хромосоме, выделить этот ген, изучить его структуру, охарактеризовать мРНК и белковый продукт этого гена. Этот метод «от гена к белку» был впервые использован при хорее Гентингтона, а с 1989 года и для изучения муковисцидоза.

Исследования генома человека в настоящее время широко проводятся в Институте молекулярной биологии имени В.А. Енгельхарда (Россия).

5. Метод амплификации ДНК. В последнее время разработан совершенно новый метод молекулярной диагностики болезней, в котором объединены все необходимые для практического здравоохранения качества: надежность, простота, высокая чувствительность, безопасность использования в клинике, универсальность.

Этот метод был открыт в 1983 году американским биохимиком Кэри Мюллисом, работающим на корпорацию Cetus, и получил название метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Журнал «Science» назвал это открытие самым выдающимся событием в области молекулярной биологии и биотехнологии за последнее десятилетие, а Кэри Мюллис в 1995 году был удостоен самой престижной научной награды – Нобелевской премии. Корпорация Cetus вознаградила Кэри Мюллиса премией в $10,000 за его изобретение, а позже, в течение общей реорганизации корпорации, Cetus продал патент на метод ПЦР фармацевтической компании Hoffmann-Ла Roche за $ 300 миллионов! Популярность методики ПЦР растет неустанно. С конца 1993 методика ПЦР была упомянута более чем в 7,000 научных публикациях.

В основе этого метода лежит размножение, амплификация специфичного участка ДНК, который нужно обнаружить для диагностики патологии. Большинство мутаций, которые вызывают наследственное заболевание, происходит в уникальных генах, которые содержатся в количестве: 1-2 копии - на геном клетки. Чтобы уловить такое редкое событие (10-5 часть генома), необходимо большое количество ДНК от пациента. А метод амплификации можно проводить на микропробах ДНК, источником которой могут служить даже смывы клеток из полости рта. Этот метод позволяет проводить диагностику и мониторинг лечения инфекционных, онкологических и наследственных заболеваний. Особенно эффективным оказывается использование ПЦР в дородовой диагностике: достаточно небольшого объема материала хориона или других клеток плода и в течение 1-2 дней можно дать ответ о наличии или отсутствии у будущего ребенка мутантного аллеля в гомо- или гетерозиготном наборе. Чрезвычайно важным является то, что это можно сделать на самых ранних этапах эмбриогенеза (8-10 недель), в отношении молчащих, нефункционирующих генов, это позволяет и врачам, и родителям принять правильное решение о ведении беременности, коррекции дефектов, подготовки семьи к ожидаемому событию. Кроме того, следует отметить, что на все виды мутаций может быть использована одна технология, которая отличается только набором праймеров. В одной капле крови, взятой у новорожденного, в виде пятна на фильтровальной бумаге достаточно ДНК для нескольких сотен тестов. Что же такое полимеразная цепная реакция и в чем суть данного метода?

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) основан на принципе естественной репликации ДНК, включающей расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей ДНК, то есть синтез новых нитей ДНК. Механизм репликации таков, что комплементарное достраивание нитей ДНК может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунетивых участках. Маркировав такими блоками специфический участок ДНК, можно добиваться протекания синтеза только в этом участке, а не по всей длине нитей ДНК. В качестве стартовых блоков выступают праймеры – это синтетические олигонуклеотиды, которые состоят из 20-30 оснований, они комплементарны участкам ДНК, которые мало подвержены генетическим изменениям. Реакция осуществляется при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы, выделенного из бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимеразы), при наличии в реакционной смеси ДНК-мишени, комплементарных к ней праймеров и дезоксинуклеозидтрифосфатов. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов, которые протекают при различных температурах:

1) расплетения двойной спирали ДНК (денатурации ДНК) при температуре 93-95оС в течение 1 минуты,

2) присоединения (отжига) праймеров, протекающего при температуре 50-65оС и

3) комплементарного достраивания цепей ДНК (удлинения), которое происходит при температуре 72о С.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации продукты синтеза служат матрицами для второго цикла амплификации, в результате которого и происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК. Начиная с третьего цикла амплификации, вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная реакция в ПЦР.

Трехступенчатый цикл, в результате которого получают точные копии идентифицируемого участка матричной ДНК, повторяется обычно 30-50 раз. С каждым новым циклом число молекул матричной ДНК возрастает в геометрической прогрессии, что позволяет проводить визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном геле. А использование термостабильной ДНК-полимеразы позволяет автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора – амплификатора, который автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации. Образование в результате реакции ферментов ДНК определенного размера оценивается как факт, свидетельствующий о наличии в биологической пробе искомого микроорганизма, если использование ПЦР проводится в диагностике инфекционных заболеваний или поврежденного участка, если проводится в диагностике наследственных болезней. Полезность ПЦР для генетических исследований была впервые доказана в исследовании серповидно-клеточной мутации на амплифицированных ДНК-фрагментах в 1985 году Saiki с соавторами. Метод ПЦР можно использовать для идентификации маркерных хромосом, которые невозможно идентифицировать обычными цитогенетическими методами, например дисгенезию гонад. Метод ПЦР является быстрым и надежным методом, который может использоваться для выявления всех типов мутаций, связанных с генетическим заболеванием - от вставок, к стиранию, к точечным мутациям. Некоторые энтузиасты предсказывают, что в пределах пяти лет любое генетическое исследование будет ПЦР обосновано. Мышечная дистрофия Дюшена - пример генетической болезни, выявление которой очень упрощено при помощи методики ПЦР. Человеческий ген dystrophin, который имеет более чем два миллиона пар азотистых оснований ДНК на X - хромосоме, является самым большим геном, идентифицированным до настоящего времени.

Сейчас существуют диагностические тест-системы, основанные на ПЦР-технологии, позволяющие выявлять возбудителей многих заболеваний человека как вирусной, так и бактериальной природы. Возможности, заложенные в ПЦР анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности, показывающей отсутствие перекрестных реакций со сходными микроорганизмами или другими агентами. Выбор праймеров позволяет в зависимости от целей диагностики выявлять уникальный вид, группу видов и род микроорганизмов. Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, называемым «золотым стандартом» для инфекционных заболеваний. Проведенная в последние годы в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики Chlamydia trachomatis показала, что быстрые тесты имеют чувствительность 40-60%, культуральное исследование – 60-80%, а метод ПЦР – 90-100%.

Высокоспецифичная диагностика таких тяжелых инфекционных заболеваний как дифтерит, бруцеллез, холера, туберкулез, листериоз, сальмонеллез и других способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции. Чрезвычайно эффективным является применение ПЦР для диагностики анаэробного возбудителя язвенной болезни желудка – Helicobacter pylori.

Еще одно направление использования метода ПЦР - определение антигенов системы HLA II класса (DR, DQ), которое позволяет с высокой степенью достоверности определить частоту носительства определенных антигенов при различных заболеваниях.

В развитых странах применение ПЦР диагностики распространено очень широко. Объем продаж ПЦР диагностикумов по данным зарубежных источников составляет более 2,5 миллиардов долларов США. Стоимость амплификационных тест-систем зарубежных производителей составляет около 1500 тысячи долларов (ПЦР-наборы фирмы «Хоффманн-Ла-Рош»), стоимость тест-систем российского производства колеблется от 100 до 250 долларов.

Существующие молекулярно-генетические методы диагностики наследственных болезней оказались настолько универсальными, что нашли применение не только в медицинской генетике, но и диагностике инфекционных заболеваний. Автоматизация существующих и разработка принципиально новых подходов к изучению структуры нуклеиновых кислот наряду с ускоренными темпами изучения генома человека и клонирования генов, ответственных за развитие патологии, позволят прогнозировать появление в недалеком будущем средств диагностики подавляющего большинства известных заболеваний человека.

 




Дата добавления: 2015-04-20; просмотров: 26 | Поможем написать вашу работу | Нарушение авторских прав

<== 1 ==> |


lektsii.net - Лекции.Нет - 2014-2024 год. (0.007 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав