Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Определение содержания белка по методу Лоури

Цель работы: освоение количественного определения белковых веществ методом Лоури в растительном и животном сырье.

Из азотистых соединений наиболее важное значение для питания человека имеют белки, которые встречаются в пищевых продуктах в значительно больших количествах, чем другие азотистые вещества. На долю белков приходится до половины сухой массы живой клетки.

В щелочной среде белки образуют с раствором сульфата меди окрашенные растворы вследствие образования биуретового комплекса. В формировании окраски при определении содержания белков методом Лоури участвуют также окрашенные комплексы, образующиеся в процессе реакции Фолина на тирозин, триптофан и цистеин.

Оборудование и реактивы: технические весы; фотоэлектроколориметр; кюветы шириной 1 см; фарфоровые ступки; мерные колбы вместимостью 100 см³; пробирки; мерные пипетки вместимостью 1 см³; градуированные пипетки вместимостью 1 см³; центрифуга; сухие бумажные фильтры; воронки; реактив А (2 г карбоната натрия растворяют в 100 см³ раствора гидроксида натрия с концентрацией 0,1 моль/дм³); реактив Б (0,5 г раствора цитрата натрия или виннокислого натрия-калия с массовой долей 1%); реактив В (смешивают непосредственно перед анализом 1 см³ реактива Б с 50 см³ реактива А); раствор альбумина с массовой долей 0,025%; реактив Фолина-Чокальтеу (в мерную колбу вместимостью 1 дм³ вносят 50 г вольфрамата натрия, 12,5 г молибдата натрия и 350 см³ дистиллированной воды, раствор охлаждают и добавляют 25 см³ раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 85% и 50 см³ концентрированной соляной кислоты. Осторожно кипятят с обратным холодильником в течение 10 ч. Затем вносят 75 г сульфата лития, 25 см³ дистиллированной воды, 2 – 3 капли брома и вновь нагревают под тягой без обратного холодильника в течение 15 мин. Полученный раствор должен быть ярко-желтого цвета и прозрачным. При появлении зеленоватого оттенка обработку бромом повторяют.

Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм³ и доводят объем до метки раствором гидроксида натрия с концентрацией 0,10 моль/дм³. Проверяют молярную концентрацию полученного раствора по кислоте (концентрация раствора должна быть 1 моль/дм³); раствор яичного белка с массовой долей 10%; прессованные дрожжи (10 г дрожжей растирают с кварцевым песком, добавляют 10 см³ дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, фильтруют через бумажный фильтр или центрифугируют); раствор казеина с массовой долей 10%.

Ход работы:

В мерную колбу, вместимостью 100 см³, вносят 10 см³ приготовленного раствора или вытяжки исследуемого продукта (яичного белка, дрожжей или казеина), доводят до метки дистиллированной водой. В пробирку отбирают 0,4 см³ разбавленного раствора для анализа, добавляют 2 см³ реактива В, перемешивают и выдерживают при темпепературе (20±1) °С в течение 10 мин. Затем вносят 0,2 см³ реактива Фолина-Чокальтеу, перемешивают и через 30 мин измеряют оптическую плотность при 500 или 750 нм на фотоэлектроколориметре с соответствующим светофильтром против контрольной пробы.

Контрольную пробу готовят аналогично, только заменяют исследуемый раствор дистиллированной водой в объеме 0,4 см³.

Для построения градуировочного графика в 5 пробирок вносят соответственно 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 см³ раствора альбумина с массовой долей 0,025 %. Первые четыре пробирки доливают дистиллированной водой до 0,4 см³. В дальнейшем анализ проводят как и для исследуемых образцов. После фотоколориметрирования полученные значения оптической плотности откладывают на оси ординат, а концентрации альбумина на оси абсцисс (l,25×10⁵; 2,5×10⁵; 5,0×10⁵; 7,5×10⁵ и 10,0×10⁵ г белка).

С помощью градуировочного графика устанавливают содержание белка в исследуемом образце.

Значения содержания белка в исследуемых продуктах, определенных с помощью метода Лоури, вносят в таблицу 14.

Таблица 14. Содержание белка в исследуемых объектах