Главная страница | Контакты | Случайная страница Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Лабораторні методи дослідження

Серед численних методів лабораторної діагностики інфекційних хвороб найбільше значення мають специфічні методи виявлення збудника (мікроскопічні,бактеріологічні серологічні,біологічні) або імунної (гуморальної,клітинної)відповіді організму в динаміці хвороби.

Пряме мікроскопічне дослідження тканиннихрідин,ексудатів і тканин є одночасно найпростішим методом. При прямій мікроскопії існує багато методик. Частіше для прямої мікроскопії готують висушені мазки; це дозволяє застосовувати різноманітні барвники,що полегшують виявлення й ідентифікацію мікроорганізмів.

Вологі препарати часто використовують для діагностики грибкових і паразитарних інфекцій. Це дослідження відіграє важливу роль у діагностиці гельмінтозних інвазій,включаючи аскаридоз,трихоцефальоз,стронгілоїдоз чи анкілостомоз.

Імунна мікроскопія – в цьому методі поєднуються специфічність імунологічних досліджень зі швидкістю прямої мікроскопії. Метод імунофлюресценції за певних навичок можна вважати універсальним – він поєднує у собі точний морфологічний аналіз із високою специфічністю і роздільною здатністю. Цей метод застосовують для діагностики гепатитів А і В, для виявлення ротавірусів у фекаліях немовлят,циркулюючих антигенів при токсоплазмозі, цитомега- ловірусній хворобі та ін. Це найперспективніший метод для діагностики практично всіх бактеріальних,вірусних та інших інфекцій.

Імуноферментне обстеження застосовують для візуального чиспектрофотометричного виявлення мікробних антигенів. Ферментозв'язувальні імуносорбентні тести (ELISA) аналогічні до імунофлюоресцентних за винятком того, що антисироватка реагує з антитілами, кон'югованими з ферментами. Після оброблення певним субстратом з'являється відповідне забарв­лення, що вловлюється звичайним світловим мікроскопом, і зникає потреба у дорогому обладнанні. Цей метод застосовують для діагностики гепатитів А і В, для виявлення ротавірусів у фекаліях немовлят, циркулюючих антигенів при токсоплазмозі, цитомегаловірусній хворобі та ін. Це найперспективніший метод для діагностики практично всіх бактеріальних, вірусних та інших інфекцій.

Електронна мікроскопія. Електронно-мікроскопічне обстеження застосовують для ідентифікації певних вірусів, для яких не характерний цитопатичний ефект у культурі клітин. Метод особливо цінний для виявлення ротавірусів у фекаліях дітей раннього віку з гастроентеритами. Велика кількість і характерна морфологія цих вірусних частинок дозволяє провести їх специфічну ідентифікацію на основі самих морфологічних ознак. Електронну мікроскопію застосовують для виявлення збудників групи нікорнавірусів, але для специфічної їхньої ідентифікації необхідна агрегація вірусних часток імунною сироваткою. За допомогою цього методу можна виявити віруси гепатитів А і В, вітряної віспи тощо.

Виявлення антитіл, мікробних антигенів, побічних продук­тів і геномів (серологічні методи). У зв'язку з відносною неспецифічністю багатьох прямих мікроскопічних методів і через необхідність для отримання результатів посіву мати достатньо часу, застосовується низка технічних прийомів, спрямованих на виявлення антитіл у сироватці крові чи інших рідких середо­вищах, швидку ідентифікацію мікробних антигенів, побічних продуктів їхньої життєдіяльності чи геномів.. Зустрічний імуноелектрофорез найширше застосовують для виявлення антигену (хоча можна ним виявляти й антитіла). Матеріал, що обстежують на наявність антигену, поміщають у канавку, що зроблена в агарі, а спеціальну антисироватку — в іншу канавку поруч. Дати через агар пропускають електричний струм, унаслідок чого відбувається швидке (протягом кількох хвилин) зближення антигену й антитіла й зливання їх з утворен­ням преципітату. Метод за чутливістю відповідає забарвленню за Грамом, але є більш специфічним. Цю реакцію застосовують для діагностики грипу, гепатиту В, виявлення стафілококового токсину, токсигенності коринебактерій дифтерії та ін.

Реакцію аглютинації (РА) застосовують для виявлення невідомих антитіл за допомогою відомого антигену й установ­лення виду мікроба за допомогою відомих антитіл. Хоча в разі застосування цієї реакції часто мають місце хибні результати, що зумовлено термолабільними компонентами сироватки і ревматоїдним фактором, її широко викорис­товують для діагностики черевного тифу, туляремії, бруцельо­зу, єрсиніозу тощо.

Реакція непрямої (РНГА) або реакція пасивної гемаглютинації (РПГА) за чутливістю перевершує реакцію аглютинації. Цього досягають використанням еритроцитів, на поверхні яких сорбуються антигени (бактеріальні чи вірусні) або антитіла. Еритроцити, сенсибілізовані антигенами, називають антиген­ними еритроцитарними діагностикумами і застосовують для виявлення й титрування антитіл. Еритроцити, сенсибілізовані антитілами, називають імуноглобуліновими еритроцитарними діагностикумами і застосовують для виявлення антигенів. Метод використовують для діагностики грипу, аденовірусної інфекції, черевного тифу, сальмонельозу, гепатиту В та ін.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) ґрунтується на здатності деяких вірусів (кору, краснухи, кишкових вірусів, вірусу грипу, арбовірусів тощо) спричиняти аглютинацію еритро­цитів. Суттю реакції є феномен запобігання (гальмування) за допо­могою імунної сироватки гемаглютинації еритроцитів вірусами.

Реакція зв'язування комплементу (РЗК) дозволяє титрувати антигени чи антитіла за ступенем фіксації комплементу комплек­сом антиген — антитіло. РЗК широко застосовують для діагнос­тики рикетсіозних і вірусних інфекцій.

Реакція нейтралізації (РН) ґрунтується на здатності антитіл нейтралізувати бактеріальні токсини і вірусні антигени. Широко застосовується для виявлення й титрування анти- стрептолізину, дифтерійного токсину, для виявлення практично всіх видів вірусів. Результати реакції враховують invitro або за біологічним ефектом.

Радіоімунний аналіз (PIA) полягає у застосуванні радіоізотопного мічення антигенів чи антитіл. Використовують переважно твердофазний варіант PIA, за якого антигени чи антитіла (залежно від мети обстеження) адсорбуються на твердому носії (целюлоза, полістирол). Суть методу полягає у реєструванні радіометричним способом кількості відомого міченого антигену (антитіла) до і після контакту його з гомологічними антитілами (антигенами). PIA—найчутливіший у даний час метод діагностики. Застосовується для діагностики гепатитів А і В, багатьох бактеріальних, рикетсіозних і протозойних захворювань.

ДНК-проби. Використання рекомбінантних ДНК-методів зробило можливим виділення, вивчення репродукції та мічення мікроорганізмів зі специфічним, унікальним розміщенням нуклеотиду. Ці мічені фрагменти ДНК можна додати до тканинних рідин, ексудатів, що ймовірно містять патогенний агент. Із отриманої суміші після обробки нагріванням чи хімічними речовинами виділяють мікробну ДНК відповідного унікального складу. Після обробки фрагменти ДНК нагрівають повторно. Ця гібридизація високоспецифічна і відбувається тільки між фрагментами, що містять взаємодоповнюючі нуклеотиди. Якщо матеріал містить нуклеотид, що послідовно доповнює той, що знаходиться в пробі, він буде гібридизований і виявлений. Перевага цього методу полягає в його унікальній специфічності й можливості знайти єдиний патоген серед безлічі інших та ідентифікувати мікроорганізми, які або важко, або неможливо виділити культуральними методами. Метод радять для діагностики вірусних, хламідійних, міко- бактеріальних, ентеробактеріальних і паразитарних інфекцій.

Отже, серологічні методи (за невеликим винятком) ґрунтуються на реакції антиген — антитіло. У серологічній діагностиці новим є виявлення належності антитіл до певного класу імуноглобулінів. Якщо вони належать до ІдМ, це дозволяє з певною ймовірністю вважати, що їхня наявність пов'язана з даною хворобою, а якщо вони належать до IgG, це свідчить про перенесену хворобу в недалекому або більш віддаленому минулому. Це іноді дає змогу зрозуміти, з чим ми маємо еправу: гострою інфекційною хворобою, рецидивом, загостренням хронічного процесу, повторним захворюванням чи штучною імунізацією.

Виявлення в сироватці крові хворого антитіла, що реагує з певним антигеном, указує лише на те, що хворий мав контакт з антигеном чи спорідненою з ним субстанцією. Якщо титр антитіл значно підвищується чи знижується, відповідну реакцію можна розцінювати як результат свіжого контакт з антигеном. У хворого з неясним захворюванням сироватку, взяту з дотриманням стерильності, необхідно зберігати в заморо­женому стані, щоб за потреби порівняти її з сироваткою, отриманою в пізніші терміни захворювання. Результати серологічних реакцій оцінюють за висотою титру та його динамікою протягом хвороби (парні сироватки беруть з інтервалом 7—14 днів).

Іноді може відбуватися неспецифічна стимуляція формуван­ня антитіл при гострому захворюванні (підйом титру аглютині­нів бруцел при гострій туляремії), що виникає тільки в разі антигенної спорідненості збудників цих захворювань. Ці неспецифічні серологічні зміни увійшли в клінічну практику. Було виявлено, що при деяких захворюваннях часто випадково утворюються сироваткові антитіла, які реагують з антигенами, що походять із не пов'язаного з етіологічним агентом джерела (який насправді може бути невідомим). Прикладами цього є гетерофільні аглютиніни при інфекційному мононуклеозі й аглютинація певних штамів протеїв сироватками хворих на рикетсіоз.

Контакт з антигеном може виникати і внаслідок попередньої вакцинації чи імунізації, що іноді утруднює трактування серологічних проб. Тому інтерпретацію результатів серологіч­них тестів слід здійснювати з урахуванням додаткової інфор­мації про хворого, включаючи такі фактори, як попереднє захворювання й імунізація, вплив хімічних, але етіологічно сторонніх антигенів, наявність динаміки антитіл.

Культуральне обстеження. Незважаючи на складність виконання й необхідність певного часу для отримання результату, виділення етіологічного агента за допомогою культивування на штучних живильних середовищах, у культурах тканин чи в експериментах на тваринах є найінформативнішим методом. Проте діагностична цінність досліджуваного методом посіву матеріалу залежить значною мірою від того, чи не був він забруднений під час забору супутньою мікробною флорою і чи був він доставлений долабораторії з дотриманням умов, що гарантують виживання нестійких мікроорганізмів.

Забір матеріалу. У тих випадках, коли матеріал для дослід­ження отримують із закритих глибоких вогнищ, ділянку шкіри, де проводять черезшкірну аспірацію матеріалу голкою, необхідно спочатку обробити 70 % етиловим спиртом, а потім продезінфікувати 2 % розчином йоду. Спочатку йодний розчин наносять у точку, з якої буде проводитись аспірація, а потім концентричними рухами — навколо цієї точки. Дезінфекційний агент повинен діяти 1—2 хв до аспірації. Усі маніпуляції необхід­но проводити продезінфікованими руками або у гумових рукавичках. Якщо перша спроба виявилася невдалою, то наступні необхідно проводити, використовуючи нові голки, через нову, попередньо продезінфіковану ділянку шкіри. Щоб уникнути алергійної реакції, після завершення маніпуляції йод видаляють за допомогою спирту. Якщо матеріал для посіву забирається з постійно діючої канюлі, ділянка забору матеріалу дезінфікується аналогічним чином.

Коли матеріал необхідно отримати з рани, що дренується, матки, синуса, вихідний отвір необхідно ретельно очистити й продезінфікувати описаним вище способом, а потім стерильний внутрішньовенний катетер або трубку ввести якнайглибше і стерильним шприцом відсмоктати через неї матеріал, що підлягає дослідженню. Із відкритих ділянок матеріал можна отримати шляхом біопсії, аспірації з краю вогнища або шляхом забору його тампоном із поверхні. У двох перших випадках рану необхідно обробити способом, описаним для забору з глибоких закритих вогнищ. Для забору матеріалу тампоном поверхню відкритого ранового вогнища обробляють тільки стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду для видалення ранового детриту і сапрофітної флори.

Транспортування. Усі матеріали, що підлягають мікро­біологічному дослідженню методом посіву, мають бути достав­лені до лабораторії якнайшвидше, бажано протягом 1 год. Подовження зазначеного терміну може призвести до загибелі вибагливих мікроорганізмів, прискореного розмноження супутньої флори, зміни кількості наявних у матеріалі бактерій, якщо не будуть вжиті спеціальні заходи, спрямовані на подолання цих небажаних процесів. Особливо важливе приско­рене транспортування в разі дослідження крові, тканинних рідин й ексудатів, у яких можуть бути патогенні мікроорганізми роду Neisseria або анаероби. Контейнер для матеріалів має буги чистим, стерильним (за винятком посуду для фекалій) і відповідним способом позначеним. Секрети органів дихання, сеча, великі шматки тканин і великі об'єми рідин можна безпечно транспортувати в пластикових контейнерах із герметичними кришками. Аспірати зручно й безпечно транспортувати в тому самому шприці, за допомогою якого здійснювався їхній забір, за умови, що все повітря з нього видалене і голка захищена стерильним ковпачком. Анаеробні мікроорганізми теж слід транспортувати в ємкості, з якої вида­лене повітря. При цьому важливо переконатися, що індикатор, який у ній знаходиться, залишається безколірним (рожевий або голубий колір указує на наявність кисню і дозволяє припус­тити, що ємкість не придатна для транспортування матеріалу). Невеликі шматочки тканини (розміром менші за 1см²) найкраще транспортувати в стерильній пробірці з гумовим корком, із якої видалене повітря. Після того, як перевірено стан індика­тора, пробірку встановлюють у вертикальному положенні, щоб звести до мінімуму втрату тяжкого інертного газу, знімають корок, поміщають матеріал у пробірку і закривають.

Мазки, які підлягають дослідженню на (3-гемолітичні стрепто­коки групи А, можна транспортувати в сухій стерильній пробір­ці. Усі інші мазки слід розміщувати в будь-якому наявному транспортному середовищі. Ці середовища запобігають як висихан­ню мікроорганізмів, що містяться на тампоні, так і прискоре­ному розмноженню невибагливих мікроорганізмів за рахунок пригнічення вибагливіших. Для транспортування матеріалів, що підлягають дослідженню на наявність анаеробної мікро­флори, є спеціальні транспортні контейнери, тому використання мазків для виділення таких мікроорганізмів не бажане.

Культуральне дослідження матеріалу. Для посіву на живильні середовища використовують кров (гемокультура) при сепсисі, тифо-паратифозних захворюваннях, чумі, сибірці, сальмо­нельозі; кал (копрокультура) при шигельозі; сечу (урино- культура), блювотні маси при сальмонельозі та інших харчових бактеріальних отруєннях; матеріал із глотки при дифтерії, кашлюку, менінгококовій хворобі; спинномозкову рідину при менінгіті, лептоспірозі; пунктат з бубонів при чумі, туляремії; виділення з виразок при сибірці.

Матеріал із верхніх відділів дихального тракту. У зв'язку з тим що гортань і носова частина глотки в нормі містять велику кількість сапрофітних і потенційно патогенних бактерій, культуральне дослідження мікрофлори цих органів використо­вують рідко, за винятком тих випадків, коли існує ймовірність наявності певних патогенних бактерій, а саме Streptococcus pyogenes, Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, менінгококів або гонококів.

Посіви з глотки. У тих випадках, коли матеріал із глотки посилають на культуральне дослідження до лабораторії без спеціальної вказівки про можливість наявності підозрілого збудника, лабораторія повідомляє тільки про наявність або відсутність у матеріалі S. pyogenes. У зв'язку з тим що у 90 % хворих на стрептококовий фарингіт збудник виявляється під час дослідження одноразово взятого мазка слизу з глотки, негативний результат такого дослідження є вельми перспектив­ним з точки зору виключення можливості такого захворювання. Подібним чином масивний або переважний ріст ß-гемолітичного стрептокока групи А з матеріалу від хворих з ознаками й симптомами стрептококового фарингіту є важливим показни­ком наявності у хворого антитільної відповіді на стрептококові антигени і, ймовірно, наявності захворювання. Значно складніше трактувати результати посівів, які дають незначний або помірно виражений ріст S. pyogenes. У більшості таких хворих імунологічні показники не підвищені, і це дозволяє вважати, що бактеріальний ріст свідчить про бактеріоносійство.

Посіви з глотки можуть не давати позитивних результатів у дорослих осіб, які скаржаться на біль у горлі, якщо у них не підвищена температура тіла, немає ознак шийної лімфаденопатії або в недавньому минулому вони не контактували з іншими хворими на стрептококовий фарингіт, тому що позитивні результати посіву відзначаються менше ніж у 5 % таких хворих. У той же час, якщо температура тіла піднімається до 38 °С і вище, шийні лімфатичні вузли болючі і відзначається набряк мигдаликів, результати посіву настільки часто бувають позитив­ними, що для того, аби уникнути втрати часу на їх очікування, більш раціонально терміново починати антибактеріальну терапію.

Посіви з ротової порожнини. У посівах із ротової порожнини часто виявляють масивний ріст змішаної флори, яка складається з аеробних і анаеробних бактерій, їх виділення має ніякого клінічного значення, за винятком тих випадків коли здійснюються спеціальні заходи для запобіганя забрудненню вегетуючою мікрофлорою.

Матеріал із нижніх відділів дихальних шляхів. У культуральне дослідження мокротиння є методом, що найчастіше використовують у діагностиці інфекцій нижніх відділів дихальних шляхів.

Крім патогенних бактерій, пневмонія може бути спричинена вірусами, рикетсіями, хламідіями, Mycoplazma pneumoniae, Legionella та іншими агентами.

Посіви сечі. Сеча як і мокротиння звичайно забруднена нормальною мікробною флорою. Кількість бактерій, що перевищує 100 000 в 1 мл сечі, свідчить про справжню бактеріурію, тоді як менша за 1000 мікроорганізмів в 1 мл відображає забруднення дослідженої порції сечі флорою, що вегетує в ділянці промежини або в сечівнику. Однак перш ніж будуть отримані дані, що підтверджують наявність інфекції, необхідно звернути увагу на такі фактори: адекватність дезінфекційних процедур; стать хворого; проміжок часу між збиранням матеріалу і його посівом; кількість виділених бактеріальних видів. Хворий повинен бути ретельно проінструктований з техніки отримання чистої порції сечі або забір її потрібно провести під наглядом досвідченого медичного працівника. У жінок необхідно розвести великі статеві губи,повторно обробити ирисечівникові ділянки відповідним дезінфекційним засобом, а потім промити теплою стерильною водою. У чоловіків подібна процедура не потрібна. Під час сечовипускання перші 20—25 мл сечі виливають, а порція для забору вловлюється безпосередньо в стерильний контейнер, не перериваючи потоку сечі. Контейнер необхідно тримати таким чином, щоб уникнути контакту зі стегнами чи промежиною. Якщо ця процедура виконана ретельно, навіть одна проба сечі, яка дала ріст більший за 100 000 колоній мікроорганізмів в 1 мл, є дуже важливою ознакою бактеріурії. У жінок для того, щоб бути впевненим у наявності інфекції, необхідно отримати ріст більший за 100 000 колоній в 1 мл сечі у 2 послідовно взятих пробах. У зв'язку з тим що сеча є добрим живильним середовищем, під час тривалого зберігання її за кімнатної температури відбувається інтенсивне розмноження забруднювальної мікрофлори. Тому проби сечі, які немає можливості доставити до лабораторії протягом 1 год з моменту їхнього отримання, повинні бути поміщені в холодильник. Вони можуть зберігатися за температури 4 °С упродовж 4—6 год без помітної зміни кількості мікроорганізмів. Здебільшого інфекції сечових шляхів спричиняються одним видом бактерій. Виділення з сечі 3 (і більше) видів мікроорганізмів часто свідчить про забруднення матеріалу, навіть якщо число колоній досить веллке. Полімікробна бактеріурія можлива, але переважно вона має місце тільки у хворих, що потребують постійного використання уретральних катетерів. Насправді, біля ЗО % інфекцій сечових шляхів супроводжуються наявністю менше за 100 000 колоній в 1 мл сечі. У сечі хворих, які отримують антимікробну терапію, а також у пробах сечі, що взяті за допомогою катетера із сечівника або сечоводу і при надлобковій аспірації, кількість мікроорганізмів невелика.

У тих випадках, коли неможливо отримати проби сечі з гарантованим захистом від забруднення або необхідно дослідити її на наявність анаеробної флори, для отримання адекватного матеріалу можна використати надлобкову аспірацію. Матеріал, що отриманий таким чином, звичайно не буває забрудненим, і тому навіть незначний ріст мікро­організмів має важливе значення. Якщо у хворого постійно функціонує катетер у вогнищі ураження, матеріал необхідно забирати безпосередньо з нього за допомогою стерильногошприца й голки після ретельної дезінфекції зовнішньої поверхні катетера. Сечу не слід брати з дренажної трубки або сечівника, тому що вони часто бувають забруднені.

Вивчення забарвлених за Грамом мазків нецентрифутованої сечі допомагає швидко діагностувати інфекції сечових шляхів. Наявність у мазку численних клітин плоского епітелію і зміша­ної бактеріальної флори свідчить про забруднення матеріалу й необхідність отримання другої його порції. Відсутність плоского епітелію й наявність 1 (або більше) бактеріальної клітини в 20 полях зору під імерсійним об'єктивом звичайно свідчить про справжню бактеріурію, особливо якщо така картина супровод­жується наявністю 1 (або більше) лейкоцита, у посіви крові. Культуральне дослідження крові необхідно проводити всім тяжкохворим із гарячкою, ознобом, у випадку підозри на ендокардит, внутрішньосудинну інфекцію або імуно- супресію. У разі підозри на вірусемію, гематогенну грибкову інфекцію, бруцельоз, туляремію, лептоспіроз або інфекцію, яка спричинена бактеріями, що мають дефектну клітинну стінку, необхідно налагодити безпосередній контакт із лабораторією для спеціального інструктажу. Чутливість більшості методів культурального дослідження залежить від об'єму досліджу­ваного матеріалу, причому кожний 1 мл крові (понад стандартний об'єм 5 мл) збільшує число позитивних резуль­татів приблизно на 2 %. Узагалі 3 послідовні посіви крові об'є­мом від 10 до ЗО мл, які взяті з інтервалом не менше ніж 60 хв, є достатньо вірогідними доказами наявності або відсутності бактеріемії. В екстремальних ситуаціях достатнім є дослідження 2 проб крові, що взяті одночасно, але з різних анатомічних ділянок. У хворих, які отримували протягом 2 попередніх тижнів антимікробні препарати, а також в осіб із підозрою на ендокар­дит рекомендується досліджувати б порцій крові, забір яких здійснюється впродовж 2 діб. Якщо хворий отримує протимікробні засоби, забір крові для посіву слід проводити безпосередньо перед отриманням хворим наступної дози препарату, а лабораторію треба своєчасно повідомити про це, аби під час проведення посіву можна було застосувати методику введення пеніцилінази, видалення антибіотика або масивного розведення досліджуваної порції крові. Забір крові в більшому об'ємі або більша кратність досліджень рідко поліпшують результати виявлення прихованої бактеріемії, якщо не застосовувати вдосконалені методи посіву, культу- ральні середовища або умови інкубації.

Найкращим способом отримання матеріалу є черезшкірна венепункція. Необхідно уникати забору крові зі стегнової вени, тому що дезінфекція шкіри в пахвинній ділянці нерідко утруд­нена, а концентрація мікроорганізмів у венозному дренажі нижніх кінцівок переважно менша, ніж у венозній крові верхніх кінцівок. Найпоширеніша загальноприйнята практика забору крові для посіву з внутрішньосудинної канюлі, що постійно функціонує, часто призводить до більшого забруднення матеріалу. Немає ніяких доказів того, що посів артеріальної крові більш результативний, ніж венозної. В окремих хворих із дисемінованим сальмонельозом, туберкульозом або глибокими мікозами іноді етіологічний агент удається виділити лише під час культурального дослідження кісткового мозку, тоді як інші методи дослідження виявляються неефективними, у' Для запобігання забрудненню матеріалу шкірною мікро­флорою місце, в якому здійснюється пункція, має бути ретельно продезінфікованим (див. вище). Відразу після аспірації необхід­но провести посів крові на рідкі живильні середовища (бульйо­ни) для виділення аеробної й анаеробної флори. Співвідношення об'ємів крові й живильного бульйону, в який проводять посів, має становити як мінімум 1:5, щоб максимально зменшити бактерицидну активність нормальної сироватки, а також вплив антимікробних агентів, що можуть бути в ній. У тому випадку, коли у хворого підозра на гематогенну грибкову інфекцію, лабораторію повинні попередити про це, тому що деякі з описаних вище технічних прийомів не ефективні щодо виділення грибів.

Дослідження пофарбованих за Грамом мазків, приготованих із шару лейкоцитів відцентрифугованої крові (світлий шар кров'яного згустку), рідко дозволяє виявити мікроорганізми. Хоча кількість їх, особливо менінгококів і стафілококів, що можуть бути виявлені в гранулоцитах, становить приблизно 4 % обстежених методом посіву проб крові, процедура потребує великих затрат часу і рідко дає відомості, потрібні для.лікування. У зв'язку з високою токсичністю амфотерицину В застосування цього препарату не слід розпочинати, не маючи достатньо вагомих доказів наявності у хворого системної грибкової інфекції. У таких випадках позитивний результат мікроскопіч­ного дослідження мазка зі світлого шару кров'яного згустку може мати неабияке значення для терапії, тому що ріст грибів виявляється лише через 2—5 діб.

Приблизно 65 % посівів крові від хворих із бактеріемією дають позитивний результат у перші 24 год культивації, а 90 % — протягом З діб. Незважаючи на суворі вимоги щодо дезінфекції в палаті, де перебуває хворий, та стерильну техніку посіву в лабораторії, іноді все ж має місце забруднення. Псевдопозитивні результати посівів крові можна запідозрити за такими ознаками: 1) під час повторних посівів рідко виділяють той самий мікроорганізм; 2) бактеріальний ріст у бульйоні з'являється переважно через 48 год культивації; 3) мікроорганізми, що виділяються, часто ідентифікуються як дифтероїди або Staphylococcusepidermidis. Однак будь-який з цих видів може іноді спричиняти бактеріемію, особливо у хворих з імуносупресією.

Спинномозкова рідина. Дослідження спинномозкової рідини від хворих із підозрою на менінгіт — це одне з найнеобхідніших досліджень, які проводять у лабораторії клінічної мікробіології. Бактеріальний менінгіт може швидко набути фатального перебігу, якщо.лікування відкладається або є неадекватним, а підбір відповідної терапії часто базується на результатах специфічної ідентифікації етіологічного агента. Необхідність термінового проведення дослідження спинномозкової рідини потребує невідкладного її отримання зразу ж після виникнення підозри на менінгіт. Якщо матеріал для дослідження був отриманий з абсцесу в центральній нервовій системі, необхідно довести до відома працівників лабораторії, щоб матеріал був досліджений як на аеробну, так і на анаеробну флору. Нестійкі мікроорганізми, які легко гинуть, особливо Neisseriameningitidis, можуть не витримати тривалого зберігання за температури, нижчої від температури людського тіла. Якщо неможливо негайно обстежити спинномозкову рідину, її слід зберігати за температури 37 °С.

Після отримання спинномозкової рідини її концентрують центрифугуванням або фільтрацією і проводять посів, мазки фарбують за Грамом. Виявлення запальних змін у спинно­мозковій рідині допомагає відрізнити гострий бактеріальний менінгіт від небактеріальних форм захворювання: при бактеріальному менінгіті переважають поліморфно-ядерні лейкоцити, тоді як при туберкульозних, грибкових або прото­зойних менінгітах клітини запалення представлені звичайно лімфоцитами і запальна реакція менш інтенсивна. Хоча на початкових стадіях розвитку асептичного менінгіту переважа­ють поліморфно-ядерні лейкоцити, вже через 8 год відбуваєть­ся виражений зсув у бік переважання мононуклеарних клітин.

Цитологічні зміни у спинномозковій рідині можуть виявлятися також у хворих з абсцесом мозку. Незважаючи на це, мазки та посіви у подібних випадках часто дають негативні результати, якщо не відбувається прориву абсцесу в субарахноїдальний простір або у шлуночки мозку. У хворих з атріовентрикулярними шунтами мазки спинномозкової рідини, пофарбовані за Грамом, мають ретельно вивчатися в пошуках мікроорганізмів, особливо менінгококів, пневмококів, Enterobacleriaceae, Listeria та стафілококів. Пофарбовані, але нежиттєздатні мікроорганізми іноді забруднюють стерильні контейнери та можуть зумовити несправжньопозитивне фарбування за Грамом. Крім того, при бактеріальних менінгітах, коли лікування вже розпочато, у грампозитивних мікро­організмів спостерігається тенденція фарбуватись як грам- негативні.

За наявності специфічних антисироваток більшість етіологіч­них агентів часто може бути швидко ідентифікована за допомогою реакції преципітації. Реакції зустрічного імуно- електрофорезу та аглютинації більш чутливі і можуть дати позитивні результати при негативних даних фарбування за Грамом. Крім того, визначення мікробних антигенів у спинномозковій рідині часто є єдиним методом ідентифікації інфекційного агента у хворих на частково лікований менінгіт. У хворих на хронічний менінгіт і з мононуклеарною запальною реакцією слід проводити культуральнє дослідження спинно­мозкової рідини на мікобактерії та грибкову інфекцію.

Матеріал із травного тракту. Посіви матеріалу з ротової порожнини, періодонтальних вогнищ ураження або слини дають ріст змішаної флори, яка складається з анаеробних та аеробних мікроорганізмів. Діагностика кандидозного стоматиту (пліснявки) та ангіни Венсана здійснюється на підставі досліджень пофарбованих мазків, отриманих із можливих вогнищ ураження.

Шлунково-кишкових фістул і тріщин прямої кишки незмінно дають ріст аеробної та анаеробної кишкової флори. Тобто ці посіви рідко надають допомогу в пошуках специфічних киш­кових патогенних агентів.

Посіви фекалій доцільно проводити для визначення етіології діареї та виявлення носійства. Цей матеріал часто досліджують методом посіву для визначення сальмонел, шигел, вібріонів та ін. Фекалії не повинні містити домішок сечі. Посів їх необхідно провести негайно або зібрати випорожнення у стерильну пробірку. Якщо доставити матеріал до лабораторії не можна протягом 1 год, фекалії повинні зберігатись у фосфатному буфері з гліцерином для того, щоб уникнути загибелі нестійких мікроорганізмів, у тому числі шигел. Звичайно рідко виникає необхідність досліджувати більше ніж 3 порції матеріалу, який збирають щоденно впродовж 3 днів.

Матеріал зі статевих шляхів. Матеріал зі статевих органів досліджують, щоб насамперед діагностувати венеричні захворювання (гонорея, сифіліс, герпес, м'який шанкер, трихо­моноз і хламідійні інфекції). Крім того, низка мікроорганізмів може уражати ендометрій, тканини маткових труб і яєчників, вапни. Матеріал для посіву з ендометрію потрібно отримувати через трубку з двома чи трьома отворами, яку вводять через продезінфікований канал шийки матки, якщо необхідно запобігти забрудненню матеріалу вагінальною або цер- вікальною флорою. Матеріал повинен бути доставлений до лабораторії у флаконі, з якого видалене повітря, або в закритому шприці, щоб гарантувати можливість виявлення анаеробних мікроорганізмів. У хворих із вагінітом матеріал отримують під прямим візуальним контролем із вагінальних склепінь за допомогою ватного тампона. У випадку підозри на трихомоноз мазок потрібно помістити у невелику кількість стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду і терміново передати у лабораторію. Якщо концентрація трихомонад достатньо висока і мазок був доставлений до лабораторії впродовж 10—15 хв, мікроорганізм можна легко ідентифікувати за характерною рухливістю у вологому препараті. Культуральне дослідження спрямоване переважно на виявлення етіологічного агента вагінітів, зокрема Gardnerellavaginalis, -гемолітичних стрепто­коків групи В і Candidaalbicans. Застосування спеціальних методів культурального дослідження підвищує ймовірність виявлення збудника інфекції.

Ексудати і тканинні рідини. Гній із недренованих. абсцесів, а також перикардіальну, плевральну, перитонеальну і синовіальну рідину найкраще отримувати шляхом черезшкірної аспірації. Попереднє промивання шприца стерильним антикоагулянтом (гепарин) дозволяє запобігти утворенню згустків. У зв'язку з тим що в інфікуванні ескудатів і тканинних рідин часто беруть участь анаеробні мікроорганізми, шприц повинен бути герметизований і негайно переданий до лабораторії. Аспірат можна помістити в спеціальні транспортні контейнери, з яких видалене повітря. Застосування тампонів для взяття матеріалу не рекомендовано, тому що ділянка, з якої беруть матеріал, часто невелика за розміром, а нестійкі мікроорганізми чутливі до висихання й окислювання. Одержання матеріалу з глибоких гнійних вогнищ, що сполучаються з поверхнею тіла через нориці або синуси, утруднене. Вивідні шляхи таких вогнищ здебільшого заселені найрізноманітнішою мікробною флорою, що, проникаючи через відкриту норицю, забруднює дренаж. У багатьох випадках ступінь забруднення можна зменшити ретельною дезінфекцією вхідного отвору й шляхів аспірації матеріалу через стерильний пластиковий катетер, уведений глибоко у норицю. Проте навіть коли проводяться всі ці захисні процедури, висіяні мікроорганізми часто не тотожні патогенним мікробам, що виділяються з операційного матеріалу. У зв'язку з цим бактеріологічний діагноз гнійних вогнищ, що дренуються, повинен базуватися на даних культурального дослідження матеріалу, отриманого методом кюретажу або біопсії, а не в;іділень з нориць. Якщо виникає підозра на актиномікоз, норицю варто прикрити або рихло затампонувати марлею і лишити її, поки вона не просякнеться ексудатом. Потім марлевий тампон лоставляють до лабораторії, де старанно досліджують на наявність гранул, які потім вибирають і ідентифікують.

Матеріал зі шкірних покривів і поверхневих ран. Матеріал, одержаний із цих утворень звичайно масивно забруднений нормальною мікрофлорою відповідних ділянок. Посіви мазків варто робити тільки у випадку наявності масивного гною або в разі потреби підтвердити наявність або відсутність тільки одного патогенного мікроорганізму, наприклад, С. сІірІїШегіае. У цьому випадку рану необхідно насамперед очистити механіч­но за допомогою ізотонічного розчину натрію хлориду длявида­лення якнайбільшої кількості ексудату. Матеріал із міхурів або ділянок запалення краще отримувати за допомогою шприца. Для успішної аспірації з вогнища запалення може знадобитися кількаразове пунктування, при цьому варто простежити, щоб наконечник пжки не торкався поверхні шкіри й шприц був герметичний. Якщо перед забором матеріалу у вогнище вводять стерильний ізотонічний розчин натрію хлориду, він не повинен містити консервантів, здатних негативно вплинути на життєздатність бактерій. Матеріал із вогнища запалення можна одержати також за допомогою пункційної біопсії після відповідної дезінфекції ділянки ураження. Так само матеріал із відкритих вогнищ може бути отриманий шляхом біопсії або аспірації з периферійних ділянок цих вогнищ за допомогою шприца й голки.

Для дослідження внутрішньовенних і внутрішньоартеріальних катетерів найкращим методом є такий: дезінфекція ділянки, у якій він пенетрує шкіру, обережне виведення катетера, асептичне відокремлення від нього сегмента завдовжки близько 5 см і негайне розміщення його у стерильному контейнері, що розташований безпосередньо біля місця забору матеріалу. Потім матеріал негайно доставляють до мікробіологічної лабораторії, де проводять дослідження. Звичайно якщо сегмент катетера забруднений під час узяття для дослідження, на агарових середовищах виростає всього декілька колоній, тоді як внутрішньосудинно інфікований катетер дає багатий бактеріальний ріст.

Вірусологічні методи. Якщо хворий обстежується на ранніх стадіях захворювання, то часто вдається виявити вірусний антиген у тканинах чи рідинах організму і виявити вірус, застосовуючи культуральні методи дослідження. Характер матеріалу, що підлягає культуральному дослідженню, й метод його транспортування залежать від природи захворювання. Для діагностики вірусних інфекцій достатньо інформативними є мазки з гортані. У зв'язку з надзвичайною лабільністю респіраторних вірусів мазки поміщають у буферні транспортні середовища з високим умістом протеїнів й антибіотиками. Якщо матеріал транспортують в інший заклад, його необхідно зберігати за температури —60 °С і перевозити у контейнері з сухим льодом. Спинномозкову рідину від хворих на менінгіт чи енцефаліт треба досліджувати культуральними методами.

Зберігають і транспортують цей матеріал аналогічно зберіганню і транспортуванню матеріалу з гортані. У хворих на респіраторні захворювання, менінгіти чи енцефаліти фекалії обстежують у разі підозри на адено- чи ентеровірусну інфекцію. Оскільки ці мікроорганізми достатньо стійкі, фекалії можна збирати у будь-яку стерильну посудину з герметичною кришкою і зберігати без заморожування. Дослідження сечі рідко інформативне, за винятком цитомєгаловірусної хвороби й краснухи. У хворих з екзантемою рідина, отримана з везикул, містить значну кількість вірусу і вірусного антигену. Дослідження перикар-діальної рідини доцільне у хворих на перикардит і міокардит. Посіви крові для виділення вірусу рідко дають позитивні резуль-тати, за винятком арбовірусних інфекцій. Техніка виділень цих вірусів високоспєцифічна, і лише незначна кількість лабораторій володіють нею. Посіви світлого шару кров'яного згустку на цитомегаловірус і вірус герпесу рекомендують для діагностики вірусної інфекції у хворих на СНІД, Біопсія мозку найефективніший метод діагностики енцефаліту, спричиненого вірусом простого герпесу. Матеріал необхідно помістити в посудину з герметичною кришкою і зберігати в замороженому стані.

Вірусологічні методи діагностики інфекційних хвороб складніші, ніж бактеріологічні. Для виділення вірусів використо­вують курячі ембріони, лабораторних тварин (часто білих мишей та морських свинок) і культури клітин. Останні викорис­товують також для визначення цитопатичного ефекту, в основі якого лежить специфічна деструкція заражених вірусом клітин, а також для проведення РН тощо.

Імунологічні методи. В останні роки методи клінічної імунології швидко розвиваються. Діагностика багатьох інфек­ційних хвороб і визначення терапевтичної тактики при таких інфекціях, як СНІД, вірусні гепатити, в даний час неможливі без вивчення функціонального стану імунної системи. Серед імунологічних тестів у практиці найчастіше визначаються імуноглобуліни, кількісний уміст загальних Т-лімфоцитів, а також, зокрема, хелперів — CD4, супресорів — CD8.

Біологічні методи полягають у зараженні лабораторних тварин шляхом уведення матеріалу, взятого від хворих (кров, сеча, пунктат бубонів, вміст елементів висипки — міхурців, пустул тощо). Мета — виділення від цих тварин збудника інфекційної хвороби (бруцельоз, чума, туляремія, сибірка тощо), проведення РН (ботулізм, правець), виявлення специфічної реакції тварини на збудника або його токсин (сап, рикетсіози, яіцур тощо).Біохімічні методи використовують для оцінки функціональ­ного стану різних органів і систем через визначення їхніх метаболітів і змін у синтезі білка, водно-електролітного балансу, ддя діагностики і визначення тяжкості стану хворого.Щоб діагностувати окремі інфекційні хвороби, застосовують також копрологічні, гістологічні, гістохімічні та інші методи досліджень.

Висновок: Ознайомлення з суб'єктивними та об’єктивними, а також лабораторними методами дослідження.